PRC1對于小鼠卵母細胞作用機制的初步研究

王新潔，許鐘峯，王海龍

（廈門大學 醫(yī)學院，福建 廈門361102）

哺乳動物的卵母細胞指雌性動物的生殖細胞，一般呈球體，且相較于體細胞體積偏大，它不僅具有一般體細胞共有的結(jié)構(gòu)，而且含有受精后胚胎早期發(fā)育所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)。卵母細胞的發(fā)育成熟是通過減數(shù)分裂進行的，在這個過程中卵母細胞進行1次DNA復(fù)制和2次連續(xù)不均等分裂，形成染色體倍數(shù)減半的單倍體配子，且將大部分營養(yǎng)物質(zhì)集中在成熟卵母細胞中，以保證卵母細胞正常受精和母源遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定［1］。

1 文獻綜述

減數(shù)分裂是卵母細胞發(fā)育成熟的重要基礎(chǔ)。以小鼠卵母細胞成熟過程為例，哺乳動物的卵母細胞在到達性成熟期前一直停滯在分裂前期，此時細胞核呈現(xiàn)膨大的狀態(tài)，核膜完整，染色質(zhì)高度疏松，該時期的細胞核呈泡狀，稱為生發(fā)泡，這一時期又稱為生發(fā)泡期（GV）。進入青春期后，卵母細胞受到促性腺激素的刺激恢復(fù)減數(shù)分裂，核膜破裂，染色質(zhì)外流，生發(fā)泡破裂（GVBD，標志著減數(shù)分裂的恢復(fù)）。GVBD之后，染色質(zhì)不斷濃縮成染色體，微管蛋白開始在微管組織中心的調(diào)控下在其周圍組裝微管。隨著微管不斷組裝，在卵母細胞中央大量微管縱向排列，組成中間寬、兩極小的紡錘體，染色體移向赤道板，卵母細胞進入減數(shù)分裂前中期（pro-MⅠ）。之后紡錘體被以微絲為主的胞質(zhì)流動牽引著向紡錘體長軸方向移動，逐漸遷移到卵母細胞皮質(zhì)膜下方。此時在靠近紡錘體一端的細胞皮質(zhì)中微絲開始活躍地組裝，并在皮質(zhì)層下方聚集呈現(xiàn)一個帽狀分布，稱為微絲帽，此時卵母細胞進入第一次減數(shù)分裂的中期（MⅠ）。MⅠ期之后，在雙極紡錘體的拉動下，同源染色體開始分離，進入第一次減數(shù)分裂末期（TI）。此時紡錘體進一步拉動同源染色體向兩極分離，紡錘體突出細胞邊緣，接著一半的染色體從卵母細胞分離，排出體積比較小的第一極體（PBI）。PBI排出后，卵母細胞內(nèi)第二次減數(shù)分裂的紡錘體迅速組裝完成，微管牽引著卵母細胞內(nèi)的染色體重新排列在赤道板上，卵母細胞進入第二次減數(shù)分裂的中期（MⅡ）。此時標志著卵母細胞成熟；成熟的卵母細胞停滯于MⅡ期，等待精子的到來，再繼續(xù)完成第二次減數(shù)分裂的過程。減數(shù)分裂的失敗可能會導致受精異常、早期胚胎發(fā)育阻滯和不良妊娠結(jié)局等。因此，充分掌握卵母細胞減數(shù)分裂調(diào)控機制對于提高卵母細胞質(zhì)量、完善以卵母細胞為基礎(chǔ)的輔助生殖技術(shù)是十分重要的。小鼠卵母細胞減數(shù)分裂的過程見圖1。

PRC1是微管結(jié)合蛋白家族中的重要成員之一，是細胞周期蛋白依賴性激酶的底物。D.Pellman等［2］于1995年首次在酵母中發(fā)現(xiàn)了PRC1的同源物Ase1蛋白，并且證明其綁定于有絲分裂紡錘體微管，作用于有絲分裂后期紡錘體移動的過程。隨后Jiang W.等［3］于1998年在HeLa細胞中發(fā)現(xiàn)并命名了PRC1蛋白，并且闡明PRC1在細胞有絲分裂的胞質(zhì)分裂過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。接著Y.Kurasawa等［4］在2004年發(fā)現(xiàn)KIF4和PRC1綁定在一起，且對于有絲分裂紡錘體的形成起著至關(guān)重要的作用。另外一項研究表明，在有絲分裂后期PRC1可以識別紡錘體微管末端的重疊區(qū)域，阻止紡錘體的解聚［5］。在最近的研究中，Guo J.等［6］于2018年在卵母細胞中發(fā)現(xiàn)PRC1蛋白在雷帕霉素機制性靶標通路中起著重要作用，它對于減數(shù)分裂進行到MⅡ期是十分重要的，揭示了PRC1在生殖細胞成熟發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能。

通過20余年的研究，學者們對PRC1的結(jié)構(gòu)和功能有了一定的了解，PRC1在紡錘體的組裝和胞質(zhì)分裂中都發(fā)揮著重要作用。雖然目前的研究表明PRC1在卵母細胞中發(fā)揮了一定作用，但在哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂中PRC1發(fā)揮何種功能、具體的作用機制又該如何描述，均有待于進一步深入探究。因此本試驗主要探討PRC1在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂中的作用，從而對PRC1在小鼠卵母細胞中的作用機制進行初步研究。

2 材料與方法

2.1 試驗動物

7～8周齡雌性昆明小白鼠（體重22～28 g），購自上海斯萊克實驗動物有限公司。小鼠飼養(yǎng)在廈門大學實驗動物中心，環(huán)境為“無特定病原體”級別，溫度控制在22℃左右。配制可供小鼠自由取食的標準鼠糧和無菌水。光照周期設(shè)置為12 h光照、12 h黑暗。

2.2 試劑與儀器

兔源抗PRC1抗體，購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；CyTM5偶聯(lián)羊抗兔二抗，購自Jackson Immuno Research公司；防熒光猝滅的DAPI封片劑，購自Vector Laboratories公司；微量RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；qRT-PCR所用試劑套裝，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑如無特殊說明，均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

高靈敏度激光共聚焦顯微鏡（型號為Zeiss LSM 880+Airyscan），購自卡爾蔡司公司；實時定量PCR儀（型號為CFX Connect Optics Module），購自伯樂公司；CO2培養(yǎng)箱（型號為3111），購自賽默飛公司；體式顯微鏡（型號為Nikon SMZ1000），購自尼康公司。

qRT-PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成，序列見表1。

表1 用于qRT-PCR的基因引物序列

2.3 關(guān)鍵試驗方法

2.3.1 卵母細胞的采集與培養(yǎng) 采用脊椎脫臼法處死小鼠，快速分離雙側(cè)卵巢。清洗干凈后用無菌刀片將卵巢充分剁碎，而后加入適量M2培養(yǎng)液搖勻。將培養(yǎng)基置于體視顯微鏡下，利用裝上拉制玻璃管（北京正天貿(mào)易有限公司）的口吸管挑選出形狀正常、周圍無顆粒細胞帶有生發(fā)泡的卵母細胞，充分洗凈后轉(zhuǎn)移至覆蓋石蠟油的M2培養(yǎng)液中，然后將培養(yǎng)皿放入溫度為37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3.2 卵母細胞免疫熒光染色 1）相關(guān)試劑的配制。PBS緩沖液：調(diào)pH值至7.4，進行高壓滅菌，之后保存于4℃；固定液：用4%多聚甲醛配制4%PBS溶液；透膜液（MPs）：用TritonX-100配制0.5%PBS溶液；洗脫液（WBF）：用Tween 20配制0.1%PBS溶液；封閉液（BBF）：用牛血清白蛋白（BSA）配制10%WBF溶液。2）卵母細胞免疫熒光染色方案。收集所需的卵母細胞置于固定液中固定30 min，然后在MPs溶液中透膜30 min，再在硫化新藍（BBF）溶液中封閉1 h。將封閉后的卵母細胞放入按1∶100BBF溶液稀釋的兔源抗PRC1抗體中，4℃孵育12～16 h。之后將卵母細胞轉(zhuǎn)移至WBF溶液中漂洗3遍，每遍5 min。再將卵母細胞轉(zhuǎn)移至按1∶500 WBF溶液稀釋后的CyTM5偶聯(lián)羊抗兔二抗中孵育1 h。之后將卵母細胞轉(zhuǎn)移至WBF溶液中漂洗3遍，每遍5 min。隨后將卵母細胞放入按1∶200 WBF溶液稀釋后的FITC偶聯(lián)的小鼠源抗α-Tubulin單克隆抗體中孵育1 h。之后將卵母細胞轉(zhuǎn)移至WBF溶液中漂洗3遍，每遍5 min。結(jié)束上述步驟之后，取適量DAPI滴在載玻片中央，將卵母細胞轉(zhuǎn)移到DAPI中，蓋上蓋玻片，避光保存于-20℃。再用高靈敏度激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

2.3.3 實時定量聚合酶鏈式反應(yīng) qRT-PCR檢測在體外成熟的4個關(guān)鍵時期卵母細胞中PRC1基因mRNA的相對表達水平，每次4個樣本，分別為體外培育0，8，10，12 h的卵母細胞，每個樣本收集到的卵母細胞數(shù)目為60～70個。首先用微量RNA提取試劑盒提取各組樣品中的總RNA，之后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，稀釋到合適濃度之后用實時定量PCR儀進行qRTPCR反應(yīng)，以β-actin作為內(nèi)參基因，最后采用2-ΔΔCt法來對目的基因mRNA相對表達量進行計算，試驗至少重復(fù)3次。試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件進行處理，并進行單因素方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 PRC1在卵母細胞發(fā)育不同時期定位的結(jié)果

為了探究PRC1在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂中的亞細胞定位情況，收集4個關(guān)鍵時期的卵母細胞進行免疫熒光試驗，結(jié)果見圖2。在GV期PRC1定位于生發(fā)泡上，在MⅠ、TI和MⅡ期PRC1都定位在整個紡錘體上。

3.2 PRC1基因在不同時期mRNA表達量分析結(jié)果

為了進一步研究PRC1基因在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中表達量的變化，收集4個關(guān)鍵時期的卵母細胞進行qRT-PCR試驗，結(jié)果見圖3。在體外培養(yǎng)8小時時卵母細胞發(fā)育到MⅠ期，PRC1基因mRNA表達量與GV期相比稍有上升，但差異不顯著（P＞0.05）；在體外培養(yǎng)10小時時卵母細胞發(fā)育到TI期時，PRC1基因mRNA表達量達到最高，與GV期相比差異顯著（P＜0.05）；在體外培養(yǎng)12小時時卵母細胞發(fā)育到MⅡ期，PRC1基因mRNA的表達量稍有下降，與GV期相比差異顯著（P＜0.05）。

4 討論

哺乳動物的卵母細胞早在胚胎時期就已形成，大多數(shù)動物出生前或出生后很短一段時間卵母細胞發(fā)育阻滯于第一次減數(shù)分裂前期的雙線期，此時被稱為初級卵母細胞。這一靜止期持續(xù)時間較長，一直到雌性動物性成熟。雌性動物進入發(fā)情期后，在促性腺激素的誘導作用下減數(shù)分裂恢復(fù)，生發(fā)泡破裂，發(fā)育至MⅡ期時排出PBI，此時被稱為次級卵母細胞。次級卵母細胞發(fā)育到MⅡ期時發(fā)生了第二次阻滯，這一靜止期持續(xù)時間較短，一直到精子的到來減數(shù)分裂才能進一步進行。與體細胞有絲分裂的不同之處在于，卵母細胞的減數(shù)分裂是不均等分裂，產(chǎn)生一個體積較大的卵母細胞和兩個體積較小的極體。減數(shù)分裂的每個步驟（如生發(fā)泡破裂、紡錘體組裝、染色體排列、紡錘體遷移和極性的形成等）都涉及到諸多基因的精準調(diào)控，只有各步驟精確配合才能保證減數(shù)分裂成功。因此，探究每個基因?qū)τ谠撨^程可能的影響顯得十分重要。

可以通過觀察蛋白在細胞中不同位置的表達情況大致推斷該蛋白可能在哪些方面發(fā)揮著生物學功能。已有研究表明，PRC1是微管結(jié)合蛋白，其對紡錘體的形成是十分重要的［7］。本試驗證明了在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中PRC1在GV、MⅠ、TI和MⅡ期都穩(wěn)定表達，且與紡錘體微管處于共定位的狀態(tài)。該結(jié)果說明PRC1可能會與其他的紡錘體微管蛋白相互作用，從而調(diào)節(jié)卵母細胞減數(shù)分裂的過程?？梢酝ㄟ^觀察基因在不同時期的mRNA表達量大致推斷該基因調(diào)控著怎樣的生理過程。之前的研究發(fā)現(xiàn)，在癌細胞中下調(diào)PRC1表達量會造成癌細胞發(fā)育阻滯，最終導致細胞凋亡［8］，說明PRC1基因表達量的不同可能會造成不同生物學功能。本試驗結(jié)果表明，以GV期卵母細胞中PRC1基因mRNA表達量為對照，隨著小鼠卵母細胞體外發(fā)育的進程，PRC1基因mRNA表達量逐漸上升，在小鼠卵母細胞體外培養(yǎng)到達TI期時基因表達量最高，只是發(fā)育到了MⅡ期之后出現(xiàn)了輕微下調(diào)。說明PRC1在TI期的高表達可能有促進第一極體排出的作用。

綜上所述，PRC1在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中與紡錘體處于共定位的狀態(tài)，并且在TI期PRC1基因mRNA水平最高，表明PRC1可能在第一極體排出的過程中發(fā)揮著重要作用。結(jié)合前期其他人的研究報道，推測PRC1可能與Rho家族成員之一GTP激動蛋白酶（MgcRac-GAP）相互作用調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的過程。與此同時，在卵母細胞中PRC1與KIF4、KIF14、胞質(zhì)連接蛋白1等紡錘體微管形成相關(guān)蛋白對于減數(shù)分裂的調(diào)控機制也值得深入探討。此外，通過查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，PRC1在家畜卵母細胞減數(shù)分裂過程中的調(diào)控機制尚不明確。因此關(guān)注PRC1在家畜生殖細胞中的作用機制具有更為重要的意義。