褪黑素合成酶ASMT基因過表達(dá)奶山羊生物安全評價(jià)研究

吳 昊，崔緒代，李云翔，楊 海，張金龍，張效生，馬文奎，張 魯，韓紅兵，吳英杰，劉海軍，袁三平，連正興，劉國世*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，北京100193；2.青島森淼實(shí)業(yè)有限公司，山東 青島266101；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300192）

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展，逐漸滲透到工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域［1-2］。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以加快畜牧品種遺傳改良，提高畜產(chǎn)品肉、蛋、奶生產(chǎn)性能［3］。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧課題組、劉國世課題組利用體細(xì)胞核移植技術(shù)先后生產(chǎn)出轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白奶牛和轉(zhuǎn)AANAT基因奶山羊［4-5］。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展及其產(chǎn)品的市場化，轉(zhuǎn)基因生物安全被廣泛關(guān)注，世界各國政府與機(jī)構(gòu)相繼制定相應(yīng)的法律法規(guī)和安全評價(jià)體系來規(guī)范轉(zhuǎn)基因生物的研究與應(yīng)用［6］。

褪黑素（melatonin，MT），是一種主要由松果體分泌的重要神經(jīng)生殖激素，具有強(qiáng)抗氧化性，能夠抗衰老、抗腫瘤，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)［7-10］。線粒體是合成褪黑素的主要場所［11］，芳烷基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（AANAT）［12］及乙酰血清素甲基轉(zhuǎn)移酶（ASMT，HIOMT）［13］是褪黑素合成過程中的限速酶。在動物體內(nèi)色氨酸（Try）經(jīng)過羥化、脫羧、乙?；图谆牟胶铣赏屎谒兀?4］。褪黑素能提高機(jī)體免疫力，抗衰老，具有巨大的醫(yī)藥和商業(yè)價(jià)值。E.Magnanou等［15］給中麝鼠句持續(xù)補(bǔ)充外源褪黑素，其壽命得到延長。A.Jenwitheesuk等［16］、ZHANG L.等［17］發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素可以延緩小鼠機(jī)體及生殖機(jī)能衰老。TAO J.等［18］發(fā)現(xiàn)，血液中高水平的褪黑素能夠提高克隆奶山羊機(jī)體免疫能力。目前，國內(nèi)外有很多褪黑素類產(chǎn)品，例如：“Night Milk”、“Slumber Bedtime Milk”、腦白金等，這些產(chǎn)品的功能主要是調(diào)節(jié)睡眠、提高機(jī)體免疫力［19］。褪黑素類功能產(chǎn)品將是未來開發(fā)熱點(diǎn)，研發(fā)褪黑素乳腺生物反應(yīng)器在家畜育種及構(gòu)建醫(yī)藥動物模型中具有重要意義。

為了研發(fā)褪黑素乳腺生物反應(yīng)器，試驗(yàn)針對用原核胚微注射技術(shù)生產(chǎn)的乳腺過表達(dá)ASMT基因嶗山奶山羊動物模型，對過表達(dá)ASMT基因品質(zhì)性狀改良的奶山羊進(jìn)行安全評價(jià)，以期為培育轉(zhuǎn)基因家畜新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)山羊?yàn)榍鄭u森淼試驗(yàn)有限公司試驗(yàn)基地的成年轉(zhuǎn)基因嶗山奶山羊群體（n=13）。所涉及轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)樣本為褪黑素合成酶基因ASMT乳腺特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因奶山羊（圖中簡稱“陽性”）10只，對照羊（圖中簡稱“對照”）3只。

1.2 試驗(yàn)試劑

PCRMIX、DHA提取試劑盒、100 bp和1 kb Marker，均購自天根生化科技（北京）有限公司；Agrose，購自北京賽百盛生物技術(shù)發(fā)展中心；DHI測定儀（型號為MilkoScanTMFT1），購自丹麥福斯集團(tuán)公司。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 轉(zhuǎn)基因陽性羊的鑒定 用采樣鉗采集原核注射轉(zhuǎn)基因羊耳樣，采用試劑盒提取耳樣DNA，測定DNA質(zhì)量。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃7 min后，4℃存放。擴(kuò)增引物信息見表1。

表1 ASMT基因PCR擴(kuò)增引物序列及長度

1.3.2 生長性能、體溫、乳成分和血液指標(biāo)的測定

分別于初生、3月齡、6月齡、12月齡時(shí)用卷尺測定羊體重、體長、體高和胸圍等體尺數(shù)據(jù)，并在同一天07：00、12：00、19：00用水銀溫度計(jì)測定羊肛門溫度。母羊產(chǎn)仔泌乳7 d后連續(xù)3 d收集乳汁，每天分別于04：00和16：00收集顏色、氣味、黏度正常的乳汁（每次5 mL），同時(shí)靜脈采血（5 mL抗凝集管收集分離血漿，-20℃避光保存）。膽固醇等6項(xiàng)血液生化指標(biāo)、單核細(xì)胞數(shù)等7項(xiàng)血液生理指標(biāo)和紅細(xì)胞數(shù)等7項(xiàng)血液紅細(xì)胞指標(biāo)在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院測定，乳中體細(xì)胞數(shù)及乳蛋白等6項(xiàng)乳品質(zhì)指標(biāo)在全國奶牛生產(chǎn)性能測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備實(shí)驗(yàn)室用DHI測定儀測定。

1.3.3 尿液、糞樣指標(biāo)的測定 將羊只保定，注射獸用呋塞米注射液針劑促進(jìn)排尿，清洗尿道口，用15 mL離心管收集3～5 mL尿液，冰上保存。白細(xì)胞數(shù)等7項(xiàng)尿液相關(guān)指標(biāo)由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院檢測。給羊只清洗肛門后，在手套上涂抹凡士林，手指從肛門進(jìn)入直腸。取直腸處糞樣，用液氮速凍后用干冰運(yùn)輸，送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行16SrDNA微生物菌群測序。

1.3.4 褪黑素濃度的測定 用高效液相色譜法測定乳中和血液中褪黑素含量。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩者之間的比較，以P ＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因羊陽性驗(yàn)證

轉(zhuǎn)基因奶山羊DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，ASMT基因比對結(jié)果見圖1。

由圖1A可知，轉(zhuǎn)基因奶山羊ASMT基因陽性擴(kuò)增片段大小為507 bp，片段大小與預(yù)期目的片段大小一致。目標(biāo)片段切膠回收后測序。圖1B的測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中ASMTmRNA（KC 290 950.1）收錄序列相似度達(dá)99.77%。圖1C的測序結(jié)果與載體PBC1-ASMT序列比對，相似度為99.01%。共獲得乳腺特異表達(dá)ASMT基因陽性羊10只，其中公羊6只、母羊4只。

2.2 奶山羊生長性能

轉(zhuǎn)基因奶山羊分別于出生、3月齡、6月齡和12月齡測定體重、體長、身高和胸圍等體尺數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，轉(zhuǎn)基因陽性奶山羊（n=10）的生長性能與對照羊（n=10）均無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 奶山羊體溫及血液生理生化指標(biāo)

2.3.1 奶山羊體溫及血液生化四項(xiàng)指標(biāo) 測定結(jié)果見圖3。

由圖3可知，轉(zhuǎn)基因陽性奶山羊（n=10）和對照羊（n=3）日體溫?zé)o顯著差異（P＞0.05），膽固醇、血糖、總蛋白、白蛋白、球蛋白含量也均無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.2 奶山羊血液生理指標(biāo)及紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)參數(shù) 測定結(jié)果見圖4、圖5。

由圖4可知，轉(zhuǎn)基因陽性羊與對照羊血液各項(xiàng)生理指標(biāo)無顯著差異（P＞0.05）

由圖5可知，轉(zhuǎn)基因陽性羊血液紅細(xì)胞相關(guān)各項(xiàng)指標(biāo)與對照羊無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.3 奶山羊尿液生理指標(biāo) 檢測結(jié)果見表2。

由表2可知，兩組奶山羊尿液中白細(xì)胞、蛋白質(zhì)、葡萄糖、酮體、尿膽元、膽紅素、潛血檢測結(jié)果均為陰性。

表2 奶山羊尿液生理指標(biāo)測定結(jié)果

2.4 奶山羊微生物指標(biāo)

采集轉(zhuǎn)基因陽性羊（n=10）和對照羊（n=3）直腸段糞便后液氮速凍，送金維智生物科技有限公司進(jìn)行16S微生物測序，共產(chǎn)生633 MB原始數(shù)據(jù)，有效數(shù)據(jù)為540 MB，見圖6。

圖6A為在綱的水平上測序物種分布柱狀圖，轉(zhuǎn)基因陽性羊與對照羊在綱水平微生物均為17種，圖6B為測序不同個(gè)體之間微生物種類距離矩陣熱圖。由圖6可知，轉(zhuǎn)基因奶山羊和對照羊糞樣菌種組成和優(yōu)勢菌群無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 奶山羊褪黑素產(chǎn)量分析

測定結(jié)果見圖7。

由圖7可知：轉(zhuǎn)基因陽性羊04：00時(shí)乳中褪黑素含量顯著高于對照羊［（51.44±1.05）ng/mL vs（45.63±0.88）ng/mL，P＜0.05］，16：00時(shí)乳中褪黑素含量也顯著高于對照羊［（46.49±0.93）ng/mL vs（33.60±1.47）ng/mL，P＜0.05］。08：00時(shí)轉(zhuǎn)基因陽性羊乳中褪黑素含量顯著高于血液［（48.53±1.27）ng/mL vs（40.04±2.57）ng/mL，P＜0.05］，對照組血液和乳中褪黑素含量無顯著差異［（38.79±2.19）ng/mL vs（37.56±2.28）ng/mL，P＞0.05］。

2.6 奶山羊乳品質(zhì)

測定結(jié)果見圖8。

由圖8可知：轉(zhuǎn)基因陽性羊和對照羊乳糖含量、乳脂含量、非脂乳固體含量、尿素氮含量均無顯著差異（P＞0.05）；轉(zhuǎn)基因陽性羊乳蛋白含量、干物質(zhì)含量顯著高于對照羊（P＜0.05），陽性羊體細(xì)胞數(shù)顯著低于對照羊（P＜0.05）。說明乳腺過表達(dá)ASMT基因嶗山奶山羊乳成分發(fā)生改變，乳品質(zhì)得到提升。

3 討論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅僅涉及科研，更涉及醫(yī)藥衛(wèi)生、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，而轉(zhuǎn)基因安全話題早已走進(jìn)千家萬戶。農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因在提高農(nóng)作物及畜牧業(yè)育種效率、改良農(nóng)作物及畜牧品種品質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用［20］。開展農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物研究是我國著眼于長久發(fā)展、推動自主創(chuàng)新的戰(zhàn)略決策［21］。目前全球基本形成了轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)的體系框架，主要是關(guān)注新表達(dá)的蛋白質(zhì)和其他新成分和可能的變化對機(jī)體及環(huán)境造成的影響［22］。2003年7月1日，國際食品法典委員會（CAC）通過了現(xiàn)代生物技術(shù)食品風(fēng)險(xiǎn)分析原則、重組DNA植物食品安全評估準(zhǔn)則、重組DNA 微生物食品安全評估準(zhǔn)則［23-24］。綜合國內(nèi)外情況，我國建立了相關(guān)法律法規(guī)和技術(shù)管理規(guī)程，包括轉(zhuǎn)基因研究、試驗(yàn)、生產(chǎn)、加工等環(huán)節(jié)［25］。國務(wù)院頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，原農(nóng)業(yè)部制定實(shí)施了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)管理辦法》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口安全管理辦法》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物加工審批辦法》四個(gè)配套規(guī)章，國家質(zhì)檢總局施行了《進(jìn)出境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫管理辦法》［26］。

本研究以原核胚顯微注射技術(shù)生產(chǎn)的過表達(dá)褪黑素合成酶ASMT基因嶗山奶山羊?yàn)檠芯繉ο?，跟蹤其生長發(fā)育情況，評價(jià)其生物安全性。K.Jackson等［27］對轉(zhuǎn)人類溶菌酶基因山羊的生長發(fā)育數(shù)據(jù)總結(jié)表明，轉(zhuǎn)人溶菌酶基因山羊生長特性與普通山羊無顯著差異。本研究也分析了轉(zhuǎn)褪黑素合成酶ASMT基因嶗山奶山羊的體重、體長、體高、胸圍等體尺數(shù)據(jù)，同樣沒有發(fā)現(xiàn)顯著變化，這說明轉(zhuǎn)ASMT基因不影響奶山羊正常發(fā)育速率。體溫異?？赡茴A(yù)示著某些代謝疫病［28］。轉(zhuǎn)基因奶山羊日體溫變化并無異常，這說明轉(zhuǎn)基因奶山羊新陳代謝正常。血液生理生化參數(shù)是健康體況的重要衡量指標(biāo)，反映機(jī)體代謝、營養(yǎng)和疾病情況［29］。本試驗(yàn)還測定了轉(zhuǎn)ASMT基因陽性羊的膽固醇、血糖、白蛋白、球蛋白等血液生化指標(biāo)，單核細(xì)胞含量、淋巴細(xì)胞含量、白細(xì)胞含量、中性粒細(xì)胞含量等血液生理指標(biāo)，這些指標(biāo)與對照羊均沒有顯著差異。紅細(xì)胞是運(yùn)輸氧氣的主要載體，同時(shí)還具有免疫功能，紅細(xì)胞指標(biāo)反映了呼吸等功能的健康狀況［30］。本研究通過測定轉(zhuǎn)基因羊血液中紅細(xì)胞含量、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞寬度等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ASMT基因并沒有對紅細(xì)胞功能造成損害。

機(jī)體內(nèi)有正常的微生物群落，腸道微生物變異影響機(jī)體自身健康［31］。對轉(zhuǎn)化編碼乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因奶牛進(jìn)行了牛腸道和土壤中微生物群落16S rDNA測序，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因?qū)εＤc道或土壤中的微生物群落沒有影響［32］。同樣對轉(zhuǎn)ASMT基因奶山羊的腸道微生物進(jìn)行了16S rDNA測序，發(fā)現(xiàn)其腸道微生物群落組成和優(yōu)勢菌群并無顯著變化。DHI指標(biāo)參數(shù)能夠反映乳品質(zhì)［33］。通過DHI測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因陽性羊乳蛋白和干物質(zhì)含量顯著高于對照羊（P＜0.05），而體細(xì)胞數(shù)顯著低于對照羊（P＜0.05），這表明轉(zhuǎn)基因陽性羊的乳品質(zhì)得到了一定程度改善。與此同時(shí)，乳中褪黑素含量明顯高于血液，這說明乳腺過表達(dá)ASMT基因后乳中褪黑素含量得到提高。體內(nèi)高褪黑素含量可提高機(jī)體抗炎能力［34］，從而降低體細(xì)胞數(shù)，這與外源褪黑素可以降低奶牛體細(xì)胞數(shù)研究結(jié)果一致［35］。

ASMT基因插入序列是山羊體內(nèi)基因克隆而來。羊自身分泌催乳素誘導(dǎo)山羊酪蛋白啟動子啟動表達(dá)ASMT基因，在山羊乳腺細(xì)胞中催化5-羥色胺（5-HT）合成褪黑素。該轉(zhuǎn)基因過程并沒有引入外源基因，只是單純地增加了羊自身基因的拷貝數(shù)，未產(chǎn)生毒性及變異蛋白，避免了基因漂流引起的生物安全。

4 結(jié)論

乳腺過表達(dá)ASMT基因陽性奶山羊與對照羊在生長性能，血液、尿液生理生化指標(biāo)及糞便微生物組成等指標(biāo)上無顯著差異。轉(zhuǎn)基因陽性羊乳中干物質(zhì)和乳蛋白含量、褪黑素含量顯著高于對照羊，而乳中體細(xì)胞數(shù)降低，乳品質(zhì)得到提高。