肉桂醛對生鮮濕面中霉菌的氣相抑制作用

王帆 劉小莉 王興娜 李春陽 周劍忠

摘要：初步研究肉桂醛對生鮮濕面中霉菌的氣相抑制作用，從生鮮濕面中分離純化出6種優(yōu)勢腐敗霉菌，18S rDNA分子鑒定結果表明，其中將2種青霉屬的霉菌鑒定為產黃青霉（Penicillium chrysogenum）和擴展青霉（Penicillium expansum），3種曲霉屬的霉菌鑒定為灰綠曲霉（Aspergillus glaucus）、阿姆斯特丹曲霉（Aspergillus amstelodami）和白曲霉（Aspergillus candidus），1種毛霉屬的霉菌鑒定為總狀毛霉（Mucor racemosus）。肉桂醛采用氣相擴散法和固相擴散法測定時均對生鮮濕面中的霉菌表現出抑制作用，其中青霉屬和曲霉屬的菌種對肉桂醛的敏感性較毛霉屬菌種高。將肉桂醛置于生鮮濕面包裝袋的密閉空間內，通過其自身的揮發(fā)性來抑制霉菌的生長，經氣相濃度為200 μL/L的肉桂醛處理后可將生鮮濕面在28 ℃下貯藏的貨架期延長35 d，說明肉桂醛具備開發(fā)成為一種氣相抑菌劑的潛力。

關鍵詞：生鮮濕面;肉桂醛;霉菌;氣相抑制;分子生物學鑒定;貨架期;抑菌圈

中圖分類號： TS213.2 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0214-03

收稿日期：2019-05-17

基金項目：江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所科研基金項目[編號：JG（2017）05]。

作者簡介：王 帆（1983—），女，江蘇南京人，碩士，助理研究員，主要從事食品微生物的研究。E-mail：wangfan713@126.com。

生鮮濕面是指壓延成型后未經干燥處理的面條，因具有較干掛面更佳的風味口感而受到消費者青睞，日本、美國、中國以及東南亞各國等已實現生鮮濕面的產業(yè)化生產[1]。生鮮濕面水分含量高，在流通和貯藏過程中易出現霉變現象，目前生產中主要采用減菌加工與化學保藏的方法延長產品的貨架期。然而化學藥物殘留在食品中會對人體造成危害，存在安全隱患。因此，研究開發(fā)安全高效的新型植物源抑菌劑替代傳統(tǒng)化學抑菌劑是生鮮濕面工業(yè)化生產中亟待解決的問題。

肉桂醛（Cinnamaldehyde），別稱3-苯基-2-丙烯醛，主要存在于樟屬植物中，是肉桂提取物肉桂油的主要成分，已被廣泛運用于食品、化妝品和醫(yī)藥領域[2]。研究表明，肉桂醛對多種細菌、真菌均具有較高的抑制活性[3-5]。但是肉桂醛具有特殊的氣味，如果直接添加到食品中會改變食品的風味和口感，因此其應用受到限制。利用肉桂醛容易揮發(fā)到空氣中變?yōu)闅庀嗟奶匦?，將其置于食品貯藏的密閉空間內，通過其自身的揮發(fā)性來有效抑制生鮮濕面中霉菌的生長和繁殖，不需要直接與食品接觸即可達到抑菌的作用。肉桂醛作為一種天然植物源化合物，具有高安全性和廣譜抑菌性，若能將其在食品加工業(yè)上開發(fā)為新型抑菌劑，可能會有巨大的研發(fā)和應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

生鮮濕面（淮安唯新食品有限公司）;肉桂醛（國藥集團化學試劑有限公司）;馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（北京路橋技術有限責任公司）;霉菌基因組DNA提取試劑盒（Solarbio Fungi Genomic DNA Extraction Kit D2300，北京索萊寶科技有限公司）;引物NS1、NS6、Premix Tap（Ex Taq Version 2.0 plus dye，RP902A）由日本寶生物工程株式會社提供。

1.2 方法

1.2.1 生鮮濕面中霉菌的分離純化及初步鑒定 采用無菌操作方法取25 g霉變的生鮮濕面樣品加入 225 mL 生理鹽水中，梯度稀釋制備成菌懸液，取100 μL稀釋液用涂布法接種到PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃下培養(yǎng)5 d。從得到的分離菌種中挑取形態(tài)各異的特征菌落，點種到新的PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃下培養(yǎng) 5 d，必要時可以反復進行上述操作，直至獲得純化的單菌落。觀察并記錄菌落特征，在光學顯微鏡下用低倍鏡和高倍鏡觀察菌絲形態(tài)及孢子囊類型，參照GB 4789.16—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 常見產毒霉菌的形態(tài)學鑒定》等對霉菌種類進行初步鑒定。

1.2.2 生鮮濕面中霉菌的分子生物學鑒定 將分離純化的霉菌，用霉菌基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取。取5 μL提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將有明顯條帶的DNA放置于-20 ℃下保存待用。采用真菌DNA擴增通用引物NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和NS6（5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′）進行18S rDNA基因的PCR擴增。PCR反應體系為50 μL：模板DNA 1 μL，正反向引物（25 μmol/L）各1 μL，Premix Tap 25 μL，加滅菌去離子水補足至50 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，38個循環(huán);72 ℃延伸5 min。反應結束后對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定擴增片段長度與目的片段長度（1300 bp左右）相同并且無雜帶后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序引物與擴增引物相同。將獲得的霉菌18S rDNA序列結果提交到NCBI的BLAST網頁（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）中，在GenBank數據庫中進行BLAST同源比對，對菌種進行分子生物學分析鑒定。

1.2.3 肉桂醛對霉菌的氣相抑制作用測定 選取生鮮濕面中的優(yōu)勢霉菌，在PDA平板上于28 ℃下培養(yǎng) 5 d 后，刮取孢子放入加有適量滅菌水的三角瓶中，用2層無菌紗布過濾去除菌絲后，加入滅菌玻璃珠振蕩搖勻，制備成孢子懸液，用血球計數板將孢子懸液的濃度調整為1×105個/mL。采用氣相擴散法測定肉桂醛對霉菌的抑制作用，方法參照文獻[6]。取100 μL孢子懸液均勻涂布于PDA平板上，待菌液被吸收后倒置放置，制成含菌平板。分別吸取不同體積（2、4、8、16 μL）的肉桂醛，均勻滴加在無菌濾紙片上，置于皿蓋內側中心形成氣相氛圍，使得培養(yǎng)皿中肉桂醛的空間含量分別為25、50、100、200 μL/L（9 cm培養(yǎng)皿的體積約為80 mL），將各培養(yǎng)皿蓋好用封口膜密封，在28 ℃下培養(yǎng)3～5 d后，采用十字交叉法測量抑菌圈大小。固相擴散法和氣相擴散法的操作大致相同，只是將含有不同體積肉桂醛的無菌濾紙片置于含菌平板中心。試驗結果的判定標準：抑菌圈直徑>15 mm為高度敏感，10～15 mm為中度敏感，7～9 mm為低度敏感，<7 mm 為不敏感[7]。

1.2.4 肉桂醛對生鮮濕面的氣相防霉作用測定 將肉桂醛溶液均勻滴加在無菌濾紙片上，置于生鮮濕面包裝袋的密閉空間內，使得包裝袋中肉桂醛的空間含量為200 μL/L（每100 g生鮮濕面的包裝體積約為200 mL），以相同空間含量的乙醇為陽性對照，未加藥液的濾紙片為空白對照。根據NY/T 1512—2014《綠色食品 生面食、米粉制品》中生面食制品菌落總數≤3×105 CFU/g的要求，測定生鮮濕面在28 ℃下貯藏的貨架期。

2 結果與分析

2.1 生鮮濕面中霉菌的分離純化及初步鑒定

從生鮮濕面中共分離純化出6種優(yōu)勢腐敗霉菌，通過觀察菌落特征、顯微鏡下的菌絲形態(tài)和孢子囊類型，初步鑒定出霉變菌種分為3個菌屬，其中2種為青霉屬，3種為曲霉屬，1種為毛霉屬，其特征描述見表1。根據其一般來源和生長特性，可以判斷生鮮濕面中大部分種類的霉菌是由原料中污染的霉菌或孢子萌發(fā)而成的，而少部分種類的霉菌則是在生產加工的過程中進入產品的。

2.2 生鮮濕面中霉菌的分子生物學鑒定

以霉菌基因組DNA為模板，采用引物NS1和NS6對18S rDNA序列進行擴增，將擴增產物用瓊脂糖凝膠進行電泳，發(fā)現在1 300 bp處出現條帶。對測序后的擴增產物在GenBank數據庫中進行BLAST同源比對，得到基因序列最為接近的已知霉菌菌株序列，序列相似度≥99%時視為同一種菌，其中將2種青霉屬的霉菌鑒定為產黃青霉（Penicillium chrysogenum）和擴展青霉（Penicillium expansum），3種曲霉屬的霉菌鑒定為灰綠曲霉（Aspergillus glaucus）、阿姆斯特丹曲霉（Aspergillus amstelodami）和白曲霉（Aspergillus candidus），1種毛霉屬的霉菌鑒定為總狀毛霉（Mucor racemosus）。6種霉菌與GenBank數據庫中已登記菌株的18S rDNA序列同源性均≥98%，菌株登錄號及名稱見表2。

2.3 肉桂醛對霉菌的氣相抑制作用測定

從表3可以看出，采用氣相擴散法和固相擴散法均測得肉桂醛對生鮮濕面中的6種霉菌具有抑制作用，且隨著加入藥液體積的增加，抑制效果也逐漸增強。各稀釋度的肉桂醛對青霉屬（A、B）和曲霉屬（C、D、E）的5種霉菌均具有很強的抑制作用，雖然采用氣相擴散法的抑制效果比固相擴散法弱一些，但是2種抑菌方式的抑菌圈直徑均>15 mm，說明青霉屬和曲霉屬的菌種對肉桂醛高度敏感。毛霉屬菌種對肉桂醛的敏感性不如青霉屬和曲霉屬的菌種強，采用固相擴散法時抑菌圈直徑>15 mm，為高度敏感，采用氣相擴散法時僅16 μL藥液處理的抑菌圈直徑大于15 mm，為高度敏感，其他藥液處理的抑菌圈直徑均在10～15 mm 之間，為中度敏感，這可能是由不同菌屬之間的差異所決定的。

2.4 肉桂醛對生鮮濕面的氣相保鮮作用測定

生鮮濕面在28 ℃下貯藏的菌落總數變化規(guī)律見表4。根據NY/T 1512—2014《綠色食品 生面食、米粉制品》中生面食制品菌落總數≤3×105 CFU/g的要求，未經任何處理的生鮮濕面在28 ℃下的貨架期僅為7 d，當菌落總數超過105 CFU/g時，生鮮濕面出現肉眼可見的黃綠色霉點;經氣相濃度為 200 μL/L 的乙醇處理后，生鮮濕面的貨架期可延長至14 d;經氣相濃度為200 μL/L的肉桂醛處理后，生鮮濕面的貨架期可延長至42 d，且最先出現的霉變?yōu)榘咨z。由此進一步驗證了肉桂醛對生鮮濕面中的霉菌具有氣相抑制效果，對青霉屬和曲霉屬霉菌的抑制作用較毛霉屬霉菌強。

3 結論與討論

本研究初步探討了肉桂醛對生鮮濕面中霉菌的氣相抑制作用。從生鮮濕面中共分離純化出6種優(yōu)勢腐敗霉菌，通過觀察菌落特征、顯微鏡下的菌絲形態(tài)和孢子囊類型，初步鑒定出霉變菌種分為3個菌屬，其中2種為青霉屬，3種為曲霉屬，1種為毛霉屬。將分離純化的霉菌，用霉菌基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，采用真菌擴增通用引物NS1和NS6對18S rDNA序列進行擴增，將擴增產物測序后在GenBank數據庫中進行BLAST同源比對，最終將2種青霉屬的霉菌鑒定為產黃青霉和擴展青霉，3種曲霉屬的霉菌鑒定為灰綠曲霉、阿姆斯特丹曲霉和白曲霉，1種毛霉屬的霉菌鑒定為總狀毛霉，6種霉菌與GenBank數據庫中已登記菌株的18S rDNA序列同源性均≥98%。采用氣相擴散法和固相擴散法測定肉桂醛對生鮮濕面中6種霉菌的抑制作用，結果表明，不同體積（2、4、8、16 μL）的肉桂醛采用氣相擴散法和固相擴散法測定時對生鮮濕面中的霉菌均表現出抑制作用，其中青霉屬和曲霉屬的菌種對肉桂醛的敏感性較毛霉屬菌種高。將氣相濃度為200 μL/L的肉桂醛置于生鮮濕面包裝袋的密閉空間內，通過肉桂醛自身的揮發(fā)性來抑制霉菌的生長，測定生鮮濕面在28 ℃下貯藏的貨架期，結果發(fā)現，未經任何處理的生鮮濕面在28 ℃下的貨架期僅為7 d，經氣相濃度為200 μL/L的肉桂醛處理后可將生鮮濕面的貨架期延長35 d，說明肉桂醛具備開發(fā)成為一種氣相抑菌劑的潛力。

參考文獻：

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