氮素形態(tài)及配比對(duì)泡核桃試管苗生根的影響

張健 王沙沙 張文娥 潘學(xué)軍

摘要：為了探索不同形態(tài)的氮素及氮素的不同配比對(duì)泡核桃（Juglans sigillata Dode.）試管苗生根的影響，采用以DKW為基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，對(duì)大量元素中的銨態(tài)氮（NH+4-N）和硝態(tài)氮（NO-3-N）比例進(jìn)行調(diào)整，研究氮素形態(tài)及配比對(duì)泡核桃生根率的影響。結(jié)果表明，DKW培養(yǎng)基中不添加銨態(tài)氮（NH+4-N ∶ NO-3-N為0 ∶ 5）可獲得較高的生根率（71.75%）和生根條數(shù)（2.67條），明顯高于對(duì)照（NH+4-N ∶ NO-3-N為1 ∶ 4），提高DKW基本培養(yǎng)基中銨態(tài)氮的含量可制約泡核桃組培苗的生長(zhǎng)，最后使整棵小植株死亡;大量元素中的K、Mg及微量元素中的Mn、Cu、B對(duì)泡核桃試管苗的生根可能起到了重要作用;生根試管苗采用珍珠巖和營(yíng)養(yǎng)土兩步煉苗，60 d后成活率達(dá)到92.00%。

關(guān)鍵詞：泡核桃;培養(yǎng)基調(diào)配;試管苗;生根

中圖分類(lèi)號(hào)： S664.104+.3 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）10-0176-06

收稿日期：2019-05-20

基金項(xiàng)目：貴州省科技重大專(zhuān)項(xiàng)子課題[編號(hào)：黔科合重大專(zhuān)項(xiàng)字（2011）6011]。

作者簡(jiǎn)介：張 ?。?994—），男，安徽臨泉人，碩士研究生，主要從事果樹(shù)種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種研究。E-mail：1047607911@qq.com。

通信作者：潘學(xué)軍，博士，教授，主要從事果樹(shù)種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種研究。E-mail：pxjun2050@aliyun.com。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為工廠化育苗的重要手段，因其再生技術(shù)具有遺傳穩(wěn)定、繁殖系數(shù)高、繁殖率穩(wěn)定、條件可控等特點(diǎn)已得到廣泛應(yīng)用，且發(fā)展前景廣闊[1]。然而，核桃屬（Juglans Linn.）植物是難生根的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，我國(guó)于20世紀(jì)80年代初就已開(kāi)始對(duì)核桃試管苗微繁殖的研究，到90年代在生根方面已取得了一定進(jìn)展[2-4]，但核桃組培苗的生根問(wèn)題一直是制約其工廠化育苗的瓶頸。因此，如何提高核桃試管苗的生根率成為廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)，有研究表明，核桃樹(shù)體中的高含量酚類(lèi)物質(zhì)被氧化成核桃醌，是導(dǎo)致核桃屬植物難生根的主要因素[5-6]，所以，相比其他樹(shù)種，核桃試管苗的生根比較困難，且因根系發(fā)育不良導(dǎo)致吸收功能較弱，這些都限制了核桃試管苗的移栽成活率。運(yùn)用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和暗處理是誘導(dǎo)核桃根原基形成的重要措施[7-8]，但是生根效果因種或品種不同而差異顯著，因此探索新方法解決核桃試管苗生根問(wèn)題和提高移栽成活率成為研究的關(guān)鍵。

氮素是植物體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、維生素、酶以及生物堿等次生代謝產(chǎn)物的重要組分，是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，在植物生命活動(dòng)過(guò)程中具有重要的生理調(diào)節(jié)功能。一般來(lái)說(shuō)，植物對(duì)氮素的需求量高于其他各種元素，氮素的主要作用是促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，提高光合能力，保證其正常生長(zhǎng)發(fā)育。與此同時(shí)，氮素也是植物生理代謝過(guò)程中起催化作用的主要物質(zhì)。大多數(shù)的植物都是以土壤中的有機(jī)以及無(wú)機(jī)態(tài)的氮素作為氮源，只有部分植物是通過(guò)根瘤菌等固氮類(lèi)的微生物固定大氣中的氮元素作為氮素的來(lái)源。銨態(tài)氮與硝態(tài)氮是植物吸收的主要氮素形態(tài)，一些可溶性的有機(jī)氮（如尿素、氨基酸等）也是植物可以吸收及利用的。而不同的氮素形態(tài)對(duì)植物的生長(zhǎng)及代謝過(guò)程有顯著差異，進(jìn)而會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生不同的生理效應(yīng)。

本試驗(yàn)以我國(guó)核桃特有種（泡核桃）的試管苗為材料，從調(diào)配DKW基本培養(yǎng)基中的氮元素入手，嘗試推測(cè)泡核桃根系在發(fā)生發(fā)育過(guò)程中對(duì)不同氮素形態(tài)的喜好，以及對(duì)不同元素在其生根中可能起到的重要作用，為核桃屬植物及難生根木本植物的生根研究提供科學(xué)的理論和技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)在貴州省果樹(shù)工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。試材為在組織培養(yǎng)室內(nèi)繼代增殖20 d的泡核桃試管苗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以DKW培養(yǎng)基的配方為基礎(chǔ)，對(duì)大量元素中的銨態(tài)氮（NH+4-N）和硝態(tài)氮（NO-3-N）比例進(jìn)行調(diào)整，設(shè)置處理1（100% NO3-N）、處理2（25% NH+4-N+75% NO3-N）、處理3（40% NH+4-N+60% NO3-N）、處理4（50% NH+4-N+50% NO3-N）、處理5（60% NH+4-N+40% NO3-N）、處理6（75% NH+4-N+25% NO3-N）、處理7（100% NH+4-N），即NH+4-N和NO-3-N的配比分別為 0 ∶ 5、1 ∶ 4、2 ∶ 3、1 ∶ 1、3 ∶ 2、4 ∶ 1和5 ∶ 0。這7個(gè)處理均按DKW基本培養(yǎng)基的配方分別加入微量元素、有機(jī)元素及鐵鹽。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DKW基本培養(yǎng)基中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮配比對(duì)泡核桃嫩莖生根的影響 以DKW培養(yǎng)基的配方為基礎(chǔ)，對(duì)大量元素中的NH+4-N和NO-3-N比例進(jìn)行調(diào)整，設(shè)置兩者的比例為0 ∶ 5、1 ∶ 4、2 ∶ 3、1 ∶ 1、3 ∶ 2、4 ∶ 1、5 ∶ 0，其微量元素、有機(jī)元素和鐵鹽保持不變。其中，1 ∶ 4的處理（即DKW培養(yǎng)基的原始配方）為對(duì)照。采用“兩步生根法”進(jìn)行生根，第一步誘導(dǎo)培養(yǎng)基為7種不同配比的DKW培養(yǎng)基，并分別附加5.0 mg/L IBA，暗培養(yǎng)12 d轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基;第二步生根培養(yǎng)基為不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的7種不同配比的DKW培養(yǎng)基，進(jìn)行光培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)生根率和生根條數(shù)。共7個(gè)處理，以上各處理均接種60瓶，每瓶2個(gè)外植體，每20瓶為1個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次。

1.3.2 泡核桃生根苗與未生根苗的營(yíng)養(yǎng)元素含量的測(cè)定 在獲得不同NH+4-N和NO-3-N配比（0 ∶ 5、1 ∶ 4、1 ∶ 1）的生根苗和未生根苗之后，以這3個(gè)處理的生根試管苗為材料，測(cè)定其全株的營(yíng)養(yǎng)元素含量。其中，1 ∶ 4的處理為對(duì)照。在測(cè)定3個(gè)處理的生根苗和未生根苗中的營(yíng)養(yǎng)元素含量時(shí)，首先將不同處理的生根苗和未生根苗從培養(yǎng)基中取出，分別小心地去掉根系和愈傷上的培養(yǎng)基，再按以下順序?qū)悠愤M(jìn)行洗滌：自來(lái)水→0.1%中性洗滌劑溶液→2次自來(lái)水→3次蒸餾水→2次重蒸水，整個(gè)洗滌過(guò)程不超過(guò)2 min，然后將樣品置于105 ℃烘箱內(nèi)殺青30 min，并在80 ℃條件下烘至恒質(zhì)量，最后用塑料粉碎機(jī)將樣品粉碎，過(guò)65目尼龍篩后，裝入密封袋保存?zhèn)溆?。樣品的測(cè)定方法如下：N含量用凱氏定氮法測(cè)定，P含量用釩鉬黃比色法測(cè)定，K含量用火焰光度計(jì)法測(cè)定;Ca、Mg、Fe、Zn、Cu、Mn含量用原子吸收分光光度計(jì)法測(cè)定，B含量用姜黃素比色法測(cè)定[9]。

1.3.3 泡核桃生根苗的煉苗移栽 選取根長(zhǎng)2 cm以上，有2～3條根，苗高4～5 cm的生根試管苗，在強(qiáng)光（3 000 lx）下鍛煉7 d后，無(wú)菌條件下將生根苗從培養(yǎng)基中取出，用無(wú)菌水洗凈根部培養(yǎng)基，0.1% KMnO4浸根10 s，移栽至盛有滅菌珍珠巖的營(yíng)養(yǎng)缽中，澆灌100 mL 1/8 DKW營(yíng)養(yǎng)液（以后每隔7 d澆1次），加蓋與營(yíng)養(yǎng)缽?fù)瑯哟笮〉乃芰媳ū３譂穸龋┖螅湃肱囵B(yǎng)室中培養(yǎng)2～3 d后，澆灌4%的多菌靈（以后每隔7 d澆1次）。培養(yǎng)室溫度為（25±1） ℃，培養(yǎng)初期光照時(shí)間為12 h/d，15 d后增至 16 h/d。培養(yǎng)室煅煉30 d，地上部葉色加深后轉(zhuǎn)移到盛有營(yíng)養(yǎng)土的營(yíng)養(yǎng)缽中進(jìn)行溫室鍛煉，生長(zhǎng)30 d左右，移栽到大田定植。

1.4 培養(yǎng)條件

上述不同NH+4-N和NO-3-N配比的生根培養(yǎng)基中，1 L均添加20 g蔗糖和6 g瓊脂，pH值為5.8～6.2。培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃，光周期為 16 h/d，光照度為40 μmol/（m2·s）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，并用DPS v7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

生根率=誘導(dǎo)生根莖段數(shù)/原接種莖段數(shù)×100%;

生根條數(shù)即每莖段平均生根數(shù);

移栽成活率=移栽成活數(shù)/總移栽數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同銨態(tài)氮和硝態(tài)氮配比對(duì)泡核桃嫩莖生根的影響

由表1可知，7種不同NH+4-N和NO-3-N配比對(duì)泡核桃嫩莖的生根率、生根條數(shù)和根系生長(zhǎng)情況影響顯著。當(dāng)配比為0 ∶ 5時(shí)，生根率和生根條數(shù)最高，分別為71.75%和2.67條，顯著高于其他處理，其根細(xì)長(zhǎng)，葉綠色，生長(zhǎng)正常;配比為1 ∶ 1時(shí)的生根率為57.50%，顯著高于配比為1 ∶ 4的（48.50%），而兩者的生根條數(shù)無(wú)差異，分別為1.67和1.25條，根粗壯;當(dāng)配比為2 ∶ 3、3 ∶ 2、4 ∶ 1和 5 ∶ 0 時(shí)，嫩莖的生根率和生根條數(shù)均為0，且葉片干枯凋落，最后整株死亡，這是由于NH+4濃度高時(shí)出現(xiàn)了氨中毒現(xiàn)象。說(shuō)明，NH+4-N和NO-3-N的適宜配比（0 ∶ 5）有利于泡核桃試管苗的生根，生根率明顯高于DKW原始配方（處理1 ∶ 4），而NH+4-N含量稍高即可制約泡核桃組培苗的生長(zhǎng)，使整棵小植株死亡（圖1-A至圖1-E）。從配比為0 ∶ 5和 5 ∶ 0 的根生長(zhǎng)情況可以看出培養(yǎng)基中N素的形態(tài)對(duì)根的誘導(dǎo)有明顯的影響。當(dāng)配比為0 ∶ 5和1 ∶ 4時(shí)的根生長(zhǎng)情況可以看出單一的N素不如2種混合使用的效果好。

2.2 不同銨態(tài)氮和硝態(tài)氮配比對(duì)試管苗大量元素含量的影響

由表2可見(jiàn)，NH+4-N和NO-3-N配比為0 ∶ 5時(shí)，泡核桃生根苗和未生根苗的N含量之間無(wú)顯著差異，P含量間有較小差異，達(dá)不到顯著水平，而K、Ca、Mg含量間存在顯著差異。其中，生根苗的K含量（4.53%）顯著高于未生根苗（4.35%），而Ca和Mg的含量（0.87%和0.09%）顯著低于未生根苗（0.96%和0.13%）。當(dāng)NH+4-N和NO-3-N配比為1 ∶ 4和1 ∶ 1時(shí)，生根苗的N、P、Ca、Mg含量明顯低于未生根苗，而兩者的K含量之間無(wú)顯著差異。由于NH+4-N和NO-3-N配比為0 ∶ 5時(shí)獲得了泡核桃試管苗的高生根率（71.75%），而該配比的生根苗中的K含量最高，Mg含量最低，且差異顯著，因此，試驗(yàn)初步認(rèn)為大量元素K和Mg對(duì)泡核桃試管苗的生根起到了重要作用。

2.3 不同銨態(tài)氮和硝態(tài)氮配比對(duì)試管苗微量元素含量的影響

通常植物以NH+4-N為氮源時(shí)，有利于對(duì)陰離子的吸收，而以NO-3-N為氮源時(shí)，有利于對(duì)陽(yáng)離子的吸收，這是由于植物吸收NH+4和NO-3后體內(nèi)保持電荷平衡所決定的。由表3可見(jiàn)，NH+4-N和NO-3-N配比為0 ∶ 5時(shí)，泡核桃生根苗中的Fe、Mn、Cu、B含量顯著高于未生根苗，而兩者的Zn含量之間無(wú)差異;當(dāng)配比為1 ∶ 4時(shí)，生根苗的Fe、Mn、Cu、B含量與未生根苗存在明顯差異，而Zn含量之間無(wú)差異。其中，生根苗的Mn含量（145.08 mg/kg）顯著高于未生根苗（127.48 mg/kg），而Cu、Fe、B含量明顯低于未生根苗;配比為1 ∶ 1時(shí)，生根苗和未生根苗的Fe、Mn、Zn、B含量之間差異顯著，而兩者的Cu含量之間無(wú)明顯差異。由于NH+4-N和NO-3-N配比為0 ∶ 5（生根率71.75%）的生根苗中的Mn、Cu、B含量較其他處理最高，且差異顯著，因此，試驗(yàn)認(rèn)為以NO-3-N為主要氮源時(shí)，泡核桃對(duì)以陽(yáng)離子為主要吸收形態(tài)的Mn、Cu等元素的吸收積累量提高，說(shuō)明微量元素Mn、Cu、B可能對(duì)泡核桃試管苗的生根起到了重要作用。

2.4 泡核桃試管苗的馴化移栽

參照潘學(xué)軍等的葡萄煉苗移栽方法[10]，溫室中珍珠巖煉苗30 d后，泡核桃生根苗的成活率為100%;轉(zhuǎn)入營(yíng)養(yǎng)土煉苗30 d最后定植于大田，成活率為92.0%（圖1-G、1-H）。

3 討論與結(jié)論

植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基主要是提供植物組織生長(zhǎng)和維持發(fā)育的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。起初在培養(yǎng)基的使用方面，主要有Whites、Chengs、MS和B5等類(lèi)型，這些培養(yǎng)基所含的營(yíng)養(yǎng)成分及濃度不同，其中，MS培養(yǎng)基的主要特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽濃度高，特別是硝酸鹽、鉀離子和銨離子含量豐富，元素平衡性好，緩沖性好，微量及有機(jī)成分含量齊全且較豐富，是目前使用最廣的培養(yǎng)基;Whites為低無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基;B5為高硝酸鉀含量培養(yǎng)基[11]。總體上來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基類(lèi)型多種多樣，應(yīng)用比較廣泛，但各種不同培養(yǎng)基都有自身的優(yōu)點(diǎn)和不足，沒(méi)有任何一種培養(yǎng)基能夠滿(mǎn)足所有植物的養(yǎng)分需求，因此，有些學(xué)者開(kāi)展了培養(yǎng)基調(diào)配的研究，如Driver和Kuniyuki研制出了核桃的專(zhuān)用培養(yǎng)基（DKW培養(yǎng)基），并廣泛用于核桃屬植物的組織培養(yǎng)上[4]。DKW培養(yǎng)基主要用于木本植物的組培，用于不同培養(yǎng)目的（增殖或生根）時(shí)，只需將其中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平或個(gè)別營(yíng)養(yǎng)成分做適當(dāng)調(diào)整，即可獲得令人滿(mǎn)意的結(jié)果，如袁巧平等又對(duì)DKW培養(yǎng)基中的一些營(yíng)養(yǎng)成分作了適當(dāng)調(diào)整并獲得了適宜于普通核桃生長(zhǎng)的改良DKW培養(yǎng)基[12]，這個(gè)培養(yǎng)基也被許多學(xué)者采納并應(yīng)用[13-14]。車(chē)代弟等以花粉萌發(fā)率和花粉管的長(zhǎng)度作為求算培養(yǎng)基組分的衡量指標(biāo)[15]，與花粉在活體中的生長(zhǎng)情形相近，優(yōu)化獲得的培養(yǎng)基配方效果較好，這對(duì)于研究者有針對(duì)性地解決植物組培工作中的某個(gè)難點(diǎn)有一定啟發(fā)。

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