染料木素磺酸鈉激活ERK信號調(diào)節(jié)腦缺血凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

張麗梅，虞子寧，黎 曉，劉瑞珍，曹性玲，李良東，黃志華

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.2018級碩士研究生；2.2019級碩士研究生；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4.第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000)

腦卒中是目前嚴(yán)重威脅人類健康和壽命的常見疾病，具有極高的致死率和致殘率。其中，缺血性腦卒中約占85%[1]。目前缺血性腦卒中的機制較為復(fù)雜[2-3]，涉及線粒體損傷、鈣超載、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、氧自由基累積、炎性反應(yīng)等病理生理多方面改變。目前已有大量文獻(xiàn)表明凋亡與缺血性腦卒中有十分密切的關(guān)系[4-6]。因此，抗凋亡干預(yù)策略一直是治療缺血性腦卒中的重要目標(biāo)。

植物雌激素在學(xué)習(xí)記憶、突觸可塑性以及神經(jīng)元再生等方面有重要調(diào)節(jié)作用[7]。染料木素(又名金雀異黃素、染料木黃酮)(genistein, Gen)，系植物雌激素的一種，在豆腐、蠶豆、大豆、野葛和羽扇豆等豆類食品中含量較高。研究已證實，染料木素對心、腦血管疾病均有較好保護(hù)作用[8-9]。然而，染料木素的水和脂溶性差，生物利用度低，使其臨床應(yīng)用和藥物開發(fā)受很大限制。為此，我們參照索志榮[10]的方法，對Gen進(jìn)行磺化，合成了強水溶性化合物——染料木素磺酸鈉(genistein-3' -sodium sulfonate, GSS)，分子式C15H10O8SNa，為白色結(jié)晶粉末。

課題組的前期研究表明，GSS可以通過抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而保護(hù)缺血性腦卒中所帶來的神經(jīng)元損傷[11-12]，但其作用機制不清楚。胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)是將信號從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵。有研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化激活的ERK可以防止神經(jīng)功能缺損和神經(jīng)元死亡，對腦缺血再灌注起保護(hù)作用[13-14]。本項目擬探討GSS是否通過ERK信號抑制細(xì)胞凋亡來減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑試劑GSS購自上海習(xí)氏化工有限公司(上海)。Tris、SDS、30%丙烯酰胺、高效裂解液購自中國索萊寶公司。 Bax、Bcl-2、Caspase 3和GAPDH的一抗及其相應(yīng)的二抗購自Cell SignalingTechnology(美國加利福尼亞州圣地亞哥)。TRIZzol Reagent購自Ambion公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermofisher。生理鹽水(NS)購自Simgen(中國北京)。超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(GE AI600UV，美國)。熒光定量PCR儀(ABI QuantStudio 7，美國)。

1.2動物SD大鼠，雄性，體重 250～300 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司[動物許可證號：SCXK(湘)2016-0002，合格證號43004700048216]。飼養(yǎng)溫度為22～25 ℃，相對濕度為50%～60%，飼養(yǎng)籠內(nèi)干燥清潔，每隔日換墊料1次。自由飲無菌純凈水，自由取用SPF清潔級飼料。所有實驗動物購回后至少適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后再進(jìn)行實驗。

1.3 MCAO模型制備及分組

1.3.1大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的制備參照LONGA等[15]的方法制備MCAO動物模型，即局灶性腦缺血再灌注損傷模型。SPF級SD大鼠，雄性，體重250～280 g，大鼠用10%水合氯醛溶液(350 mg·kg-1，ip)麻醉，作正中切口，切開皮膚并分層鈍性分離皮下組織，用眼科鑷輕輕分離頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，于向心端夾閉頸總動脈、遠(yuǎn)心端夾閉頸內(nèi)動脈，于遠(yuǎn)心端結(jié)扎并剪斷頸外動脈，用眼科剪于頸外動脈作一斜切口，將一尼龍線(長4 cm，線體直徑0.26 mm，頭端直徑0.36 mm)經(jīng)頸外動脈切口緩慢向頸內(nèi)動脈入顱方向推進(jìn)，以頸總動脈分叉處為標(biāo)記，推進(jìn)18～20 mm感到輕微阻力時，即達(dá)到較細(xì)大腦前動脈，阻斷大腦中動脈的所有血液供應(yīng)，縫合皮下組織和皮膚，2 h后，拔出尼龍線至頸外動脈處，并剪去尼龍線殘端，完成腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組大鼠只暴露和分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，并結(jié)扎頸內(nèi)動脈，不閉塞大腦中動脈。術(shù)中嚴(yán)格控制室溫在23～25 ℃。

1.3.2實驗分組及給藥方法①將大鼠隨機分成3組：采用大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)動物模型，分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注損傷模型組、模型組+GSS組(2 mg·kg-1)。模型組+GSS組于缺血后10 min分別從舌下靜脈注射不同劑量的GSS，假手術(shù)組和模型組給予同體積的生理鹽水。②將大鼠隨機分成5組：采用MCAO動物模型，分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注損傷模型組、模型組+GSS組(2 mg·kg-1)、模型組+GSS+U0126組、模型組+ U0126組。假手術(shù)組、模型組、模型+GSS組在造模前30 min于側(cè)腦室注射溶劑DMSO，模型+GSS+U0126組和模型+U0126組于側(cè)腦室注射U0126，給藥量均為1.0 μL。藥物治療組于缺血后10 min分別從舌下靜脈注射不同劑量的GSS，假手術(shù)組和模型組給予同體積的生理鹽水。

1.3.3側(cè)腦室給藥方法大鼠麻醉后，剔除頭頂部毛發(fā)，固定于立體定位儀，按前囟后0.9 mm，顱骨中縫旁開1.6 mm定位后，分離顱頂部皮膚和皮下組織，暴露顱骨和前囟，顱骨鉆打孔，微量泵注射器于硬膜下3.0 mm入皮層。參考文獻(xiàn)[16]設(shè)U0126的劑量為1 μg/只，U0126的濃度為1 μg·μL-1，給藥體積為1.0 μL，給藥速度0.25 μL·min-1。

1.4 Westernblot方法將大腦皮層組織加入細(xì)胞裂解液充分裂解，12 000×g，4 ℃離心5 min，BCA方法行蛋白定量，取50 μg總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性，經(jīng)SDS/PAGE凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至NC膜，封閉后，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h，增強化學(xué)發(fā)光試劑孵育1 min后曝光、顯影和定影，對結(jié)果進(jìn)行吸光度掃描分析，并與對照組結(jié)果進(jìn)行對比。

1.5 Realtime-PCR方法TRIzol提取總RNA，酶標(biāo)儀測總RNA的濃度和純度，取4 μg RNA樣本，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：反應(yīng)板置冰上，向反應(yīng)孔加入cDNA 2 μL、1x SYBR10 μL，10 μM引物2 μL，加超純水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性20 min，95 ℃變性10 s，61 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，共40個循環(huán)。引物：Bax: 5' TGGTTGCCCTTTTCTACTTTGC 3', 5' CAGCCACAAAGATGGTCACTGTC 3'；Bcl-2: 5' CTGTGGATGACTGAGTACCTGAACC 3', 5' AGACAGCCAGGAGAAATCAAACAG 3'；Caspase3：5' GAACGAACGGACCTGTGGAC 3', 5' AACCATGACCCGTCCCTTG 3'；B-Actin：5' TGTGACGTTGACATCCGTAAAGAC 3', 5' GGACTCATCGTACTCCTGCTTG 3'。

2 結(jié) 果

2.1 GSS對缺血再灌注損傷大鼠皮層半損傷區(qū)ERK的激活作用如圖1所示，與對照組相比，模型組p-ERK的蛋白表達(dá)水平明顯降低，經(jīng)GSS治療后p-ERK的蛋白表達(dá)水平顯著升高。

圖1 GSS對缺血半損傷區(qū)ERK蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平的影響

2.2 U0126阻斷了GSS對凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用如圖2所示，模型組與對照組相比，Bax和Caspase 3的mRNA水平明顯升高, Bcl-2的mRNA水平明顯降低；經(jīng)GSS(2 mg·kg-1)治療后, Bax和Caspase3的mRNA水平顯著下降, Bax的mRNA水平顯著升高。結(jié)果表明，GSS可抑制凋亡對腦缺血起保護(hù)作用。與單純GSS治療組相比，經(jīng)側(cè)腦室給予ERK抑制劑(U0126)后， Bax和Caspase 3的mRNA水平明顯升高，Bcl-2的mRNA水平明顯降低?？梢姡琔0126阻斷了GSS對MCAO大鼠凋亡相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用。

圖2 U0126和GSS對缺血半損傷區(qū)Bax、Bcl-2和Caspase 3mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

神經(jīng)元凋亡是缺血性腦卒中的病理特征性改變之一。Bcl-2基因家族是目前較公認(rèn)與凋亡密切相關(guān)的基因，在神經(jīng)系統(tǒng)中，Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡的標(biāo)記因子[17]，Bcl-2有抑制凋亡的作用，Bax則起促進(jìn)凋亡的作用：若Bcl-2表達(dá)增多，形成Bcl-2-Bcl-2同源二聚體或形成Bcl-2-Bax異源二聚體時，起抑制細(xì)胞凋亡的作用；若Bax表達(dá)增多，則形成Bax-Bax同源二聚體，起促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，同時損傷線粒體，并介導(dǎo)細(xì)胞色素C及其他促凋亡蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)，最終誘發(fā)Caspase依賴性死亡和非依賴性死亡。Caspase-3是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白[18]。在細(xì)胞凋亡階段發(fā)生的級聯(lián)反應(yīng)中凋亡信號將其激活，裂解相應(yīng)的胞漿和胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞 DNA 損傷和細(xì)胞凋亡[19]。我們的前期研究結(jié)果表明，GSS可以保護(hù)MCAO模型誘導(dǎo)的腦損傷，其涉及的潛在機制是增加Bcl-2/Bax表達(dá)率以及降低Caspase3活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[12]。

ERK信號通路參與細(xì)胞的多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、遷移、分化和死亡[20]。大多數(shù)研究證實，神經(jīng)細(xì)胞中的ERK信號通路具有抗凋亡的作用，它的下游包含了凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax等)，在缺血性腦卒中發(fā)揮了重要作用。我們的結(jié)果顯示：給予GSS治療后p-ERK的蛋白表達(dá)水平明顯增加，提示GSS可能通過提高ERK的活化，減輕腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。為了證明GSS是否通過ERK調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，我們用了ERK抑制劑干預(yù)GSS的作用，結(jié)果顯示，U0126阻斷了GSS對凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，說明GSS很可能是通過ERK信號調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)起保護(hù)作用。

綜上所述，GSS可能通過激活ERK信號通路，抑制促凋亡相關(guān)基因Bax和Caspase3的表達(dá)，升高抑凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制缺血性腦卒中損傷后的細(xì)胞凋亡，從而減輕神經(jīng)元損傷。本項目研究為開發(fā)一種新型抗凋亡藥物來治療缺血性中風(fēng)提供了實驗依據(jù)，但是GSS是如何激活ERK信號進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡仍然有待研究。