常見淚腺上皮性腫瘤中EGFL7的表達(dá)及其與血管生成和細(xì)胞增殖活性的相關(guān)性研究

邢其棋，張 芳，劉 棟，劉夫玲

0引言

腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多步驟的動(dòng)態(tài)過程，涉及腫瘤細(xì)胞的黏附、降解、移動(dòng)和血管生成、增殖等事件。類表皮生長因子結(jié)構(gòu)域7(epidermal growth factor like domain7，EGFL7)的研究涉及血管形成過程中的關(guān)鍵性作用。本文擬檢測常見淚腺上皮性腫瘤中EGFL7的表達(dá)，及其與微血管密度(microvascular density，MVD)、腫瘤細(xì)胞增殖活性(Ki67)的相關(guān)性。為腫瘤的預(yù)后判定及抗血管生成治療提供新的探索。

1材料和方法

1.1材料收集2009-01/2019-01青島市市立醫(yī)院住院手術(shù)患者10例正常淚腺組織(正常淚腺組織取自因炎性假瘤、Mikulicz病等良性淚腺腫瘤切除后，標(biāo)本中的部分正常淚腺組織)和46例淚腺上皮性腫瘤患者，術(shù)后病理分別為淚腺多形性腺瘤20例、多形性腺癌12例、腺樣囊性癌14例。主要試劑：兔抗EGFL7單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，鼠抗CD34單克隆抗體、鼠抗Ki67單克隆抗體(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批通過,所有患者均知情同意。

1.2方法采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(streptavidin-peroxidase，SP)，行高溫高壓修復(fù)抗原處理，染色步驟按SP試劑盒提供的說明書進(jìn)行。用磷酸鹽緩沖鹽液(PBS)替代一抗作陰性對(duì)照，用已知陽性切片作陽性對(duì)照。

評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：EGFL7染色判定標(biāo)準(zhǔn)參照 Shimizu等[1]曾描述的方法進(jìn)行評(píng)定和積分。由兩位高年資病理科醫(yī)師獨(dú)立完成高倍鏡下觀察每張切片單個(gè)視野內(nèi)染色陽性細(xì)胞及比例計(jì)數(shù)。根據(jù)陽性細(xì)胞占同類細(xì)胞總數(shù)的百分率及細(xì)胞染色強(qiáng)度綜合判定。具體為：(1)染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞漿不顯色，0分；胞漿呈淡黃色，1分；胞漿呈棕黃色，2分；胞漿呈棕褐色，3分。(2)陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)≤10%，記為0分；10%～<40%，記為1分；40%～<70%，記為2分；≥70%，記為3分。(3)染色強(qiáng)度評(píng)分+陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分=總評(píng)分；總積分0～1分為陰性，大于2分為陽性；<2分為(-)，2～3分(+)，4～5分(++)，>5分(+++)。Ki67是以細(xì)胞核染成均一的棕褐色，胞漿及胞膜不著色為陽性細(xì)胞。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)算100個(gè)腫瘤細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)，取其均值為Ki67指數(shù)(Ki67LI)。微血管密度(MVD)的測定參照Weidner建議的方法[2]：CD34陽性染色以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性，計(jì)數(shù)微血管染色(CD34)呈棕黃色的單個(gè)或成簇細(xì)胞群，計(jì)數(shù)時(shí)需要排除管腔直徑大于8個(gè)紅細(xì)胞的或管壁肌層較厚的微血管。計(jì)數(shù)時(shí)先用低倍鏡找出3個(gè)微血管最密集的區(qū)域，然后再用200倍鏡在上述3個(gè)視野中分別計(jì)數(shù)微血管數(shù)，最后取其平均值即為該腫瘤組織的微血管密度值。

2結(jié)果

2.1 EGFL7在正常淚腺及常見淚腺上皮性腫瘤中的表達(dá)情況EGFL7的陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色著色(圖1)，主要表達(dá)在淚腺多形性腺癌與腺樣囊性癌的腫瘤細(xì)胞中，EGFL7在12例多形性腺癌中的陽性表達(dá)率為83%(10/12)，其中弱陽性率為17%(2/12)，中等陽性率為42%(5/12)，強(qiáng)陽性率為25%(3/12)(表1)，在14例腺樣囊性癌中的陽性表達(dá)率為86%(12/14)，其中弱陽性率為21%(3/14)，中等陽性率為36%(5/14)，強(qiáng)陽性率為29%(4/14)。而在多形性腺瘤及正常淚腺組織中幾乎無陽性表達(dá)。采用Fisher確切概率法檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示EGFL7在腺樣囊性癌及多形性腺癌中的表達(dá)明顯高于多形性腺瘤及正常淚腺組織中的表達(dá)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而在正常組織與多形性腺瘤中的表達(dá)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)，同樣在腺樣囊性癌與多形性腺癌中的表達(dá)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)，見表1。

2.2 MVD在常見淚腺上皮性腫瘤中的表達(dá)情況CD34相關(guān)抗原染色后，可以看到在切片組織中的腫瘤微血管染色呈棕黃色的單個(gè)或成簇細(xì)胞群(圖2)。腺樣囊性癌組織中的微血管密度為(43.43±4.60)、多形性腺癌(32.58±14.46)，顯著高于多形性腺瘤(4.20±1.19)。采用方差分析結(jié)果顯示，在常見淚腺上皮性腫瘤中MVD的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。組間兩兩比較的結(jié)果顯示MVD在腺樣囊性癌及多形性腺癌中的表達(dá)明顯高于多形性腺瘤，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而在腺樣囊性癌與多形性腺癌之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.822)。

圖1EGFL7在多形性腺癌和腺樣囊性癌中的表達(dá)情況A: EGFL7在多形性腺癌中的表達(dá)(+)(10×10, IHC); B:EGFL7在多形性腺癌中的表達(dá)(+)(10×40, IHC); C:EGFL7在腺樣囊性癌中的表達(dá)(+)(10×10, IHC); D: EGFL7在腺樣囊性癌中表達(dá)(+)(10×40, IHC)。

圖2CD34在腺樣囊性癌和多形性腺癌中的表達(dá)A:CD34在腺樣囊性癌中的表達(dá)(10×20, IHC); B:CD34在多形性腺癌中的表達(dá)(10×20, IHC)。

圖3Ki67在腺樣囊性癌和多形性腺癌中的表達(dá)A:Ki67在腺樣囊性癌中的表達(dá)(10×10, IHC); B:Ki67在多形性腺癌中的表達(dá)(10×10, IHC)。

表1 常見淚腺上皮性腫瘤及正常淚腺中EGFL7蛋白的表達(dá)例

2.3 Ki67在常見淚腺上皮性腫瘤及正常淚腺中的表達(dá)Ki67相關(guān)抗原染色后，我們可以觀察到，該抗原在所有分組中均有不同程度的表達(dá)，陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕褐色(圖3)。采用Ki67指數(shù)(Ki67LI)表示Ki67在組織中的表達(dá)情況。在淚腺多形性腺癌中的Ki67表達(dá)量最高為(44.83±13.68)，其次是腺樣囊性癌(26.29±8.44)，在淚腺多形性腺瘤(2.80±3.14)及正常淚腺組織(0.40±0.70)中亦有少量表達(dá)。采用方差分析結(jié)果顯示，在常見淚腺上皮性腫瘤及正常淚腺組織中Ki67的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。且組間兩兩比較均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。

2.4常見淚腺上皮性腫瘤中EGFL7的表達(dá)水平與MVD及Ki67的關(guān)系經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在常見淚腺上皮性腫瘤中EGFL7的表達(dá)水平與MVD的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(rs=0.897，P<0.001)，與Ki67的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(rs=0.837，P<0.001)，見表2。

等級(jí)例數(shù)CD34Ki67LI-236.19±8.005.81±6.16+631.33±8.1425.67±5.51EGFL7++1037.70±11.4537.80±2.39+++745.71±14.2848.00±5.03

3討論

EGFL7屬于一個(gè)小基因家族，是由Fitch等[3]和Nichol等[4]首次發(fā)現(xiàn)，EGFL7高表達(dá)與胚胎發(fā)育早期，并證實(shí)了其在胚胎過程中主要介導(dǎo)引起內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)并遷移到正確的位置形成血管管腔，缺乏EGFL7的表達(dá)可導(dǎo)致胚胎血管管腔形成障礙[5]。EGFL7被血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌后停留在其附近，表明其可能跟細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)，介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用[6-8]。目前研究發(fā)現(xiàn)EGFL7在多種人類惡性腫瘤中均有表達(dá)[9-10]，包括肺癌、膠質(zhì)瘤[11]、結(jié)直腸癌、肝癌[10]、胃癌[12]、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、卵巢癌[13]和腎癌[14]。EGFL7在各種腫瘤中的表達(dá)升高已被證明它在腫瘤的新生血管生成、腫瘤增殖及侵襲中發(fā)揮核心作用[15]。此外，近年來的研究表明，EGFL7還具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷徙、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]、免疫逃逸[17]等作用。

血管生成在病理?xiàng)l件下，這一過程將導(dǎo)致疾病的進(jìn)展與增殖，例如，腫瘤的持續(xù)快速生長需要血管生成平衡向原血管生成因子傾斜，以保證腫瘤有足夠的營養(yǎng)供應(yīng)[18]。腫瘤增殖生長與有絲分裂活性有關(guān)[19]，許多來自細(xì)胞核細(xì)胞周期分析的報(bào)告顯示，Ki67存在于細(xì)胞周期的G1、S和G2階段，這暗示了它在許多腫瘤中作為細(xì)胞增殖標(biāo)志物的作用[20]。

在此前，有研究發(fā)現(xiàn)[20]，在腦膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)Ki67與MVD呈顯著正相關(guān)，且與腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)，說明該研究支持增殖活性依賴于血管生成水平。EGFL7的表達(dá)也與Ki67呈正相關(guān)[21]，且提示EGFL7的上調(diào)與腫瘤的增殖和侵襲密切相關(guān)。Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在靶向抑制了EGFL7的表達(dá)以后腫瘤的生長速度變慢，增殖活性降低，這進(jìn)一步說明EGFL7的表達(dá)與腫瘤的增殖活性有密切關(guān)系。

在本實(shí)驗(yàn)研究中，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測了EGFL7在常見淚腺上皮性腫瘤組織中的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)EGFL7在正常淚腺組織和多形性腺瘤中幾乎沒有表達(dá)，而在多形性腺癌及腺樣囊性癌中顯著表達(dá)。使用CD34抗體標(biāo)記常見淚腺上皮性腫瘤中的微血管，結(jié)果顯示，在腺樣囊性癌及多形性腺癌組織中的MVD顯著高于多形性腺瘤，并且淚腺多形性腺瘤、腺樣囊性癌及多形性腺癌中EGFL7的表達(dá)與MVD之間有明顯的正相關(guān)性，提示EGFL7可能在淚腺上皮性腫瘤的血管生成中起作用。Torben等[23]在基因工程小鼠、免疫缺陷裸鼠模型體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)相對(duì)于單獨(dú)應(yīng)用抗 VEGF 藥物，聯(lián)合抗 EGFL7、抗VEGF 能明顯減緩腫瘤生長。有研究中發(fā)現(xiàn)EGFL7 對(duì)轉(zhuǎn)移性直腸癌患者一線化療聯(lián)合貝伐單抗有預(yù)測價(jià)值。因此，EGFL7可能成為惡性淚腺上皮性腫瘤臨床進(jìn)展的一個(gè)新的預(yù)測因子。

此外，在多形性腺癌及腺樣囊性癌組織標(biāo)本中Ki67的表達(dá)明顯高于多形性腺瘤及正常淚腺組織，說明在惡性淚腺上皮性腫瘤中的增殖活性明顯高于正常淚腺組織及多形性腺瘤。了解EGFL7在淚腺上皮性腫瘤的良惡性腫瘤的進(jìn)展過程中的表達(dá)，這有利于抗血管生成治療在淚腺上皮性腫瘤中的應(yīng)用。

通過對(duì)EGFL7在淚腺上皮性腫瘤中表達(dá)的研究，我們發(fā)現(xiàn)EGFL7在淚腺上皮性腫瘤中不僅可以促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，而且一定程度上促進(jìn)腫瘤的增殖，通過不同的環(huán)節(jié)、不同方式對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，從而促進(jìn)淚腺上皮性腫瘤發(fā)生、發(fā)展。通過該實(shí)驗(yàn)研究表明，EGFL7可能成為評(píng)估淚腺上皮性腫瘤預(yù)后的分子標(biāo)記物，并有可能成為淚腺上皮性腫瘤抗血管治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。