房水中IL-6和MCP-1濃度與視網(wǎng)膜靜脈阻塞合并黃斑水腫的相關(guān)性

梁雪嬌，杜紅艷

0引言

視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)是視網(wǎng)膜血管疾病患者視力下降或喪失的第二大常見原因。其特征是視網(wǎng)膜靜脈栓塞導(dǎo)致視網(wǎng)膜毛細(xì)血管壓力增加，使毛細(xì)血管迂曲擴(kuò)張，導(dǎo)致血管通透性增加、細(xì)胞外液滲入視網(wǎng)膜以及不同程度的水腫。黃斑水腫(macular edema，ME)是RVO的主要并發(fā)癥，表現(xiàn)為黃斑區(qū)視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層的囊樣水腫，并可引起中心視力的下降，也是導(dǎo)致突然無痛性視力喪失的主要原因之一[1-2]。其發(fā)病機(jī)制仍未明確。近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，炎癥可能是導(dǎo)致RVO合并ME(RVO-ME)的原發(fā)因素，視網(wǎng)膜缺血、缺氧會誘導(dǎo)眼內(nèi)液中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)增加，導(dǎo)致血管通透性增加并破壞血-視網(wǎng)膜屏障(blood retina barrier，BRB)，參與ME的形成[3-4]。目前我國關(guān)于房水中白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)與RVO相關(guān)性的研究相對不足，本研究主要是分析玻璃體腔內(nèi)注射雷珠單抗(intravitreal ranibizumab injection，IVR)治療前后RVO患者前房水中IL-6與MCP-1濃度的變化，探討IL-6和MCP-1與RVO發(fā)病機(jī)理的相關(guān)性，進(jìn)一步完善RVO的發(fā)病機(jī)制，為RVO-ME的治療提供更充分的理論依據(jù)。

1對象和方法

1.1對象隨機(jī)選取2017-11/2019-11在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院確診為RVO并接受IVR治療的患者40例40眼作為治療組，其中男24例，女16例，年齡40～72(平均61.15±7.21)歲。年齡相關(guān)性白內(nèi)障通常被認(rèn)為是一種非炎癥性疾病，既往研究[5-9]選取白內(nèi)障患者作為對照組，以說明炎癥與其他眼部疾病(如葡萄膜炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、青光眼等)的關(guān)系，故本研究選取同期需行白內(nèi)障手術(shù)的單純年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者20例20眼作為對照組，其中男13例，女7例，年齡55～68(平均62.25±3.84)歲。兩組患者性別構(gòu)成比、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。本研究經(jīng)倫理委員會審批通過，所有患者及家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn)治療組：(1)散瞳后經(jīng)三面鏡查眼底、熒光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA)、光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)檢查確診為RVO-ME，且未經(jīng)任何治療；(2)OCT顯示黃斑區(qū)中心凹厚度(central macular thickness，CMT)>250μm；FFA檢查顯示視網(wǎng)膜靜脈延遲充盈，管壁滲漏；(3)經(jīng)眼底照相檢查顯示視網(wǎng)膜靜脈迂曲擴(kuò)張，可見片狀或火焰狀出血，伴有黃斑區(qū)視網(wǎng)膜水腫；(4)病程<3mo。對照組：(1)除患有年齡相關(guān)性白內(nèi)障外無其他眼部疾??；(2)無眼部藥物治療史及手術(shù)史；(3)無全身炎癥及免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病等[10-11]。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn)(1)近6mo內(nèi)曾接受過眼科手術(shù)，如青光眼手術(shù)、局部視網(wǎng)膜激光光凝術(shù)、玻璃體切割術(shù)、玻璃體腔藥物注射等；(2)由RVO以外的視網(wǎng)膜疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、高度近視等引起的ME；(3)伴有其他眼部疾病，如牽拉性視網(wǎng)膜脫離、玻璃體積血、青光眼或高眼壓癥以及眼部炎性疾病等；(4)患有未得到控制的高血壓、心肌梗塞、心絞痛、腦梗塞、血糖控制不穩(wěn)定的糖尿病、免疫系統(tǒng)疾病及意識障礙等；(5)處于妊娠期或哺乳期；(6)近3mo內(nèi)有全身及局部抗炎藥物或激素使用史；(7)依從性差，不同意進(jìn)行取樣及房水檢測[11-12]。

1.2方法

1.2.1術(shù)前準(zhǔn)備術(shù)前所有患者均被告知本研究目的、手術(shù)過程、術(shù)中及術(shù)后可能出現(xiàn)的并發(fā)癥等情況，并進(jìn)行全身及眼部相關(guān)檢查，排除惡病變及手術(shù)禁忌證。

1.2.2房水采集及治療方法

1.2.2.1治療組術(shù)前3d使用左氧氟沙星滴眼液點(diǎn)術(shù)眼，6次/d；術(shù)前剪睫毛、沖洗淚道、0.9%氯化鈉注射液15mL沖洗結(jié)膜囊，以預(yù)防感染。在眼科專用無菌手術(shù)間手術(shù)，患者取仰臥位，用鹽酸丙美卡因滴眼液點(diǎn)術(shù)眼行表面麻醉，碘伏消毒術(shù)眼3遍，鋪巾，貼膜，放置開瞼器，先用5%聚維酮碘沖洗結(jié)膜囊，再予以0.9%氯化鈉注射液15mL沖洗結(jié)膜囊，將帶有29G針頭的一次性無菌胰島素注射器針頭于角膜緣內(nèi)1mm行前房穿刺，采集房水0.1mL。將房水樣品收集在無菌EP管中，并立即在-15℃冰箱中冷藏保存?zhèn)溆?。房水采集后立即抽取雷珠單抗注射?.05mL(0.5mg)，取顳上方距角膜緣3.5mm處，垂直于鞏膜面進(jìn)針，將藥物緩慢推入玻璃體腔，注射完畢后，濕棉簽按壓30s，涂紅霉素眼膏，無菌敷料遮蓋患眼。術(shù)后給予左氧氟沙星滴眼液點(diǎn)眼(4次/d)、紅霉素眼膏(睡前1次)涂眼1wk局部抗炎治療，以預(yù)防感染。治療組患者采用1+PRN的治療方案，首次行IVR治療1mo后根據(jù)復(fù)查時眼底情況再決定是否治療，若復(fù)查時OCT顯示視網(wǎng)膜仍存在黃斑水腫伴CMT≥250μm或視力下降2行及以上，則需再行IVR治療，在IVR之前再次對所有患者的房水進(jìn)行取樣。本研究納入治療組患者經(jīng)復(fù)查后所有患者均再次行玻璃體腔藥物注射術(shù)。IVR及房水標(biāo)本的收集均由同一外科醫(yī)生進(jìn)行。

1.2.2.2對照組對照組患者均于白內(nèi)障超聲乳化吸除術(shù)聯(lián)合Ⅰ期人工晶狀體植入術(shù)前收集房水樣本，樣本采集及保存方法同治療組。

1.2.3房水中IL-6濃度和MCP-1濃度檢測將房水樣本冷藏送至北京智德檢驗(yàn)中心，Human IL-6 Flex Set試劑盒和Human MCP-1 Flex Set試劑盒、流式細(xì)胞儀均購自美國Becton Dickinson公司，采用流式CBA(Cytometric Beads Array)法檢測房水中IL-6 和MCP-1水平。將樣本放入離心機(jī)，13000r/min離心15min。配置Beads混合液和PE混合液后，取50μL Beads混合液于50μL的樣本中，將其置于震蕩儀中混合均勻，避光靜置1h。吸取50μL PE混合液，加入上述避光靜置完的混合液中，放入震蕩儀中震蕩混勻，再避光靜置2h。吸取1mL BD Wash Buffer加入避光完成的離心管中，洗滌，蓋好離心管管帽，上下顛倒2次，離心10min，棄去上層液體，再加入300μL BD Wash Buffer。蓋好離心管管帽，手指撥打離心管使Beads充分懸浮，上機(jī)檢測。

圖1治療組患者房水中IL-6和MCP-1濃度及CMT的相關(guān)性A：術(shù)前房水中IL-6濃度與CMT的相關(guān)性；B：術(shù)前房水中MCP-1濃度與CMT的相關(guān)性；C：術(shù)前房水中IL-6與MCP-1濃度的相關(guān)性。

1.2.4術(shù)后隨訪觀察治療組患者分別于首次IVR術(shù)前和術(shù)后1mo進(jìn)行最佳矯正視力(best corrected visual acuity， BCVA)和CMT檢查。BCVA采用國際標(biāo)準(zhǔn)視力表檢測，將小數(shù)視力換算為最小分辨角對數(shù)視力(LogMAR)形式記錄，以便進(jìn)行統(tǒng)計分析。CMT采用光學(xué)相干斷層成像(OCT-2000)測量。隨訪1a，觀察并記錄治療組患者并發(fā)癥發(fā)生情況。

2結(jié)果

2.1兩組患者房水中IL-6和MCP-1濃度比較術(shù)前，治療組和對照組患者房水中IL-6濃度分別為49.84±16.16、10.71±7.26pg/mL，MCP-1濃度分別為547.75±108.45、235.65±34.45pg/mL，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.927、16.603，均P<0.001)。首次IVR術(shù)后1mo，治療組患者房水中IL-6和MCP-1濃度分別為20.08±11.56、228.35±70.6pg/mL，均較術(shù)前顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=23.750、21.574，均P<0.001)。

2.2治療組患者CMT和BCVA改善情況首次IVR術(shù)后1mo，治療組患者BCVA(0.55±0.25)較術(shù)前(0.88±0.33)顯著改善，CMT(298.63±67.73μm)較術(shù)前(519.85±132.74μm)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.212、16.676，均P<0.001)。

2.3治療組患者房水中IL-6和MCP-1濃度及CMT的相關(guān)性Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，術(shù)前，治療組患者房水中IL-6和MCP-1濃度均與CMT呈正相關(guān)(r=0.646、0.912，均P<0.001，圖1)，表明隨著CMT的增厚，房水中IL-6和MCP-1的表達(dá)升高。而術(shù)前治療組患者房水中IL-6與MCP-1濃度亦呈正相關(guān)性(r=0.902，P<0.001)。

2.4治療組患者術(shù)后并發(fā)癥情況隨訪1a期間，治療組患者中，出現(xiàn)結(jié)膜下出血2例2眼，未予以處理，自行吸收，均未出現(xiàn)眼壓升高、視網(wǎng)膜脫離、眼內(nèi)炎、葡萄膜炎等并發(fā)癥及全身不適。

3討論

RVO是一種常見的視覺障礙性疾病，廣泛累及視網(wǎng)膜周圍血管，其眼底主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜靜脈血管迂曲擴(kuò)張，沿受累靜脈分布的線狀、片狀或彌漫性火焰狀視網(wǎng)膜出血，如若累及黃斑區(qū)，可見黃斑區(qū)視網(wǎng)膜水腫或棉絨斑，視盤水腫、邊界不清[13]。根據(jù)阻塞部位，RVO主要分為視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion，BRVO)和視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(central retinal vein occlusion，CRVO)[14]。目前世界范圍內(nèi)RVO患病率為0.77%，其中BRVO占0.64%，CRVO占0.13%。截止到2015年，世界上約有2 806萬人患有這種血管性疾病，其中BRVO的發(fā)生率約是CRVO的6倍[15]。RVO主要好發(fā)于50歲以上中老年人，有研究表明，其患病率隨著年齡的增長而顯著增加，但沒有性別差異[16]。RVO的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前主要認(rèn)為視網(wǎng)膜靜脈血栓形成、血管痙攣、靜脈血管本身的炎癥引起血管管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管壓力增加，使毛細(xì)血管迂曲擴(kuò)張，靜脈回流受阻，同時視網(wǎng)膜不同程度的缺血、缺氧，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致BRB破壞、血管通透性增加、體液滲入視網(wǎng)膜形成不同程度水腫[15，17]。Ascaso等[18]發(fā)現(xiàn)，炎癥細(xì)胞因子在RVO病程中起重要作用。

IL-6是活化T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及某些腫瘤細(xì)胞分泌的一種分子蛋白，是具有多種功能的炎癥細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中，IL-6 mRNA的表達(dá)隨著缺氧時間的增長明顯增加，表明長時間缺氧可刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-6[19]。IL-6可以作用于內(nèi)皮細(xì)胞，使得肌絲排列進(jìn)行重構(gòu)，原有內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，管壁通透性增加，促進(jìn)蛋白質(zhì)等外漏；也可以通過間接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)而增加血管通透性和新生血管生成[3，20]。另外，IL-6還可以促進(jìn)血栓形成，導(dǎo)致血管閉塞，誘導(dǎo)RVO的發(fā)生[21]。Feng等[22]研究結(jié)果顯示，RVO患者房水中IL-6的濃度顯著升高，且IL-6濃度隨著RVO-ME病情的加重而升高，是參與RVO-ME病程發(fā)展的重要炎性因子，該結(jié)論與Noma等[23]研究結(jié)果相符合。本研究中，術(shù)前治療組患者房水中IL-6濃度明顯高于對照組，且IL-6濃度與CMT呈正相關(guān)，這表明RVO患眼視網(wǎng)膜缺血、缺氧會誘導(dǎo)眼內(nèi)液中IL-6表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步加重黃斑水腫。

MCP-1是第一個被發(fā)現(xiàn)的屬于C-C家族的炎癥趨化因子。C-C家族是趨化因子家族的4個亞科之一，除C-C家族外，還包括CXC、CX3C、C家族[24]。MCP-1是一種小分子肝素結(jié)合蛋白，與受體(CCR2)結(jié)合后可發(fā)揮多種生物學(xué)活性功能。既往研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的緊密性，視網(wǎng)膜缺血缺氧、動脈硬化和氧化應(yīng)激時會增加MCP-1表達(dá)，MCP-1可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白(如緊密連接蛋白-1、Occludin蛋白)磷酸化，造成BRB破壞，進(jìn)而促進(jìn)RVO-ME的發(fā)生[17，25]。MCP-1也可以趨化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向病損區(qū)域定向遷徙和聚集，從而激活巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞可吞噬受損細(xì)胞的殘片或分泌多種細(xì)胞因子來促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。此外，MCP-1還可以刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基及釋放溶酶體酶，加重組織損傷[26-27]。Suzuki等[28]研究結(jié)果顯示，RVO患者房水中MCP-1濃度顯著升高，且MCP-1水平隨著RVO-ME病情的加重而升高，是參與RVO-ME病程發(fā)展的重要炎癥趨化因子。Zeng等[10]檢測了RVO患者房水中39種炎癥趨化因子，發(fā)現(xiàn)RVO患者房水中白細(xì)胞介素-8(IL-8)、趨化因子-9(CXCL9)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等表達(dá)顯著升高，但MCP-1表達(dá)正常。本研究中，我們通過對RVO患者房水中MCP-1濃度進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)RVO患者房水中MCP-1的表達(dá)水平明顯增加，且MCP-1濃度與黃斑水腫的程度呈正相關(guān)，這表明MCP-1在RVO-ME的病程中起重要作用。

Andrey等[29]研究證實(shí)RVO患者房水中IL-6、MCP-1的表達(dá)顯著增強(qiáng)，且IL-6和MCP-1的表達(dá)之間存在關(guān)聯(lián)，IL-6可能通過誘導(dǎo)MCP-1表達(dá)而間接誘導(dǎo)血管滲漏發(fā)生，形成黃斑水腫。IL-6與MCP-1共同參與了RVO-ME的發(fā)病過程，RVO患者視網(wǎng)膜血管閉塞后繼發(fā)的炎癥反應(yīng)可促使單核細(xì)胞分泌大量的IL-6、MCP-1等細(xì)胞因子[30]，IL-6既可以通過誘導(dǎo)肌動蛋白絲的重排導(dǎo)致相鄰細(xì)胞間的縫隙連接，從而增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，也可以增強(qiáng)VEGF和MCP-1等多種細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致新生血管的生成、血管通透性增加[31]。在MCP-1的作用下大量的炎性因子向炎癥或病損部位定向遷移及聚集，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白磷酸化，造成BRB破壞，進(jìn)而介導(dǎo)并參與RVO的病程。本研究中也發(fā)現(xiàn)治療組患者術(shù)前房水中IL-6濃度與MCP-1濃度具有相關(guān)性，隨著IL-6濃度的升高，MCP-1水平也升高(r=0.902，P<0.001)。總而言之，在視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài)下，局部微環(huán)境的改變誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和MCP-1，這兩種因子可相互作用導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)增加，共同參與RVO-ME的形成。研究認(rèn)為，阻斷IL-6和MCP-1治療可以延緩或減慢RVO病程的進(jìn)展[32]。雷珠單抗是一種可以結(jié)合VEGF-A所有亞型的單克隆人源化抗體片段，隸屬于抗VEGF藥物，其分子量小、親和力高，能很好地抑制新生血管的生成[17]。目前已有研究證實(shí)，雷珠單抗可以中和眼內(nèi)VEGF，從而降低VEGF的有效濃度，降低視網(wǎng)膜血管的通透性，中斷正反饋途徑，進(jìn)一步抑制炎癥，從而緩解黃斑水腫。另一方面，其可以通過減少TNF-α對視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)層的刺激，進(jìn)而抑制VEGF的生成，減輕黃斑水腫[33-34]。本研究中，治療組患者IVR治療后房水中MCP-1及IL-6濃度明顯降低，BCVA與CMT較治療前顯著改善，表明雷珠單抗可明顯降低MCP-1及IL-6濃度，減輕黃斑水腫程度，提高患者視力。

綜上所述，本研究表明以IL-6為主的炎性因子和以MCP-1為主的趨化因子均參與了RVO-ME的發(fā)病過程，且IL-6和MCP-1的濃度與RVO-ME的嚴(yán)重程度相關(guān)，提示炎性因子和趨化因子可以促進(jìn)RVO病程的進(jìn)展，為治療RVO-ME提供了新的治療靶點(diǎn)。然而，由于本研究樣本量較小且隨訪時間有限，且檢測樣本為房水而非玻璃體液，關(guān)于房水中炎癥細(xì)胞因子濃度與RVO的相關(guān)性、IL-6與MCP-1的相互作用機(jī)制、IVR治療RVO的長期療效及術(shù)后遠(yuǎn)期并發(fā)癥等情況，還需要大樣本、多中心的隨機(jī)對照研究進(jìn)一步驗(yàn)證。