植物精油對草菇雙額巖小糞蠅的產卵驅避效果及毒力測定

吳 華，戴建青，陳大嵩，歐劍峰，黃 鴻

(廣東省科學院，廣東省生物資源應用研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260)

植物精油是植物揮發(fā)油的總稱，是植物體內的揮發(fā)性次生代謝物，由分子量相對較小的簡單化合物組成，在土壤中可迅速降解。植物精油對害蟲的生物活性較高，作用方式多樣，主要為驅避、引誘、觸殺、熏蒸及種群抑制等(呂建華等，2006)。有研究表明：許多非寄主植物精油對昆蟲有產卵驅避作用，可以阻止昆蟲在寄主植物上產卵繁殖，從而使寄主植物免遭害蟲為害 (張茂新等，2003；黎卓維等，2007)。

雙額巖小糞蠅Bifronsinabifrons(Stenhammar)是廣州地區(qū)草菇Volvariellavolvacea的主要害蟲(歐劍峰等，2009)。而針對植物精油單組分對草菇害蟲雙額巖小糞蠅作用活性研究還鮮見報道。因此，本文研究了14種植物精油單組分化合物對草菇害蟲雙額巖小糞蠅產卵驅避效果，以期找到能夠對雙額巖小糞蠅具有顯著驅避效果的活性化合物，為雙額巖小糞蠅的無公害防治提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

雙額巖小糞蠅采自白云區(qū)人和鎮(zhèn)東坤草菇栽培場，選取健康活潑成蟲吸入三角瓶中帶回實驗室，飼養(yǎng)于裝有300 g草菇培養(yǎng)料(廢棉花55%，稻草40%，生石灰5%；折合干料100 g)的塑料盒(17 cm×12 cm×5 cm)中，塑料盒用100目的紗網(30 cm×30 cm×30 cm)罩住，放在RXZ型(多段編程)智能人工氣候箱(寧波江南儀器廠制造)中保溫保濕，溫度保持在22～25℃，濕度在80%以上。連續(xù)飼養(yǎng)3代后，形成穩(wěn)定的實驗室種群備用。

1.2 主要試劑與儀器

α-松油醇、檸檬醛、香茅醛、3-蒈烯、香葉醇、芳樟醇，單體香料，含量95%，均購于江西吉安吉水縣俊達天然香料油廠。β-蒎烯、α-蒎烯、異松油烯、月桂烯、丁香酚，含量95%，均購于江西省贛南天然香料油有限公司。檸檬烯95.0%、茴香醛99.0%，購于廣東翁江化學試劑有限公司。β-石竹烯90%，購于東京化成工業(yè)株式會社。吐溫-80，購自山東淄博海杰化工有限公司。RXZ型(多段編程)智能人工氣候箱為寧波江南儀器廠產品。

1.3 藥劑配制

精油的配制：用1 000 mg/L的吐溫水溶液將各精油稀釋成最終有效濃度為625 mg/L、1 250 mg/L、2 500 mg/L、5 000 mg/L、10 000 mg/L、20 000 mg/L的乳化液，備用。

1.4 供試化合物對雙額巖小糞蠅的產卵驅避作用

采用選擇性產卵驅避率法(黎卓維等，2007；胡黎明等，2012)試驗：塑料盒(17 cm×12 cm×5 cm)裝300 g草菇培養(yǎng)料(折合干料100 g)，噴施10 000 mg/L的精油乳化液5 mL為處理組，以噴施1 000 mg/L的吐溫水溶液5 mL為對照組。1個處理組和1個對照組對角放置于1個網籠(75 cm×75 cm×75 cm)內，網籠內放入雙額巖小糞蠅雌、雄各50頭。通風放置24 h后調查產卵量。5點取樣草菇培養(yǎng)基表層(層厚<2 cm)，將所取樣品混合后稱取50 g培養(yǎng)基，用20倍放大鏡來調查草菇培養(yǎng)料里面的產卵數(shù)。每個處理5次重復。評價供試化合物對雙額巖小糞蠅產卵的驅避作用。計算公式為：

選擇性產卵驅避率(%)﹦[(C-T)/(C+T)]×100

式中，C為對照組卵量，T 為處理組卵量。

1.5 供試化合物對雙額巖小糞蠅的各蟲態(tài)的毒性試驗

選擇在室內對雙額巖小糞蠅產卵驅避效果明顯的植物精油單組分化合物進行各蟲態(tài)毒性試驗。參照曲紹軒等(2015)實驗方法。供試蟲態(tài)包括 1日卵齡卵、2日齡蛹、3齡幼蟲和羽化后1日齡成蟲。每個處理重復5次，每重復20粒(頭)。成蟲培養(yǎng)于紗網養(yǎng)蟲籠內的塑料盒(17 cm×12 cm×5 cm)裝300 g草菇培養(yǎng)料(折合干料100 g)中，取5 mL的10 000 mg/L精油乳化液直接對成蟲和紗網進行噴霧處理，對照組噴5 mL的 1 000 mg/L 吐溫水溶液。其它各蟲態(tài)分別放置于直徑70 mm的培養(yǎng)皿內，皿內鋪有濾紙保濕，取2 mL 的10 000 mg/L精油乳化液噴霧處理，對照組噴2 mL的1 000 mg/L吐溫水溶液，其中幼蟲添加草菇培養(yǎng)料，其他蟲態(tài)不添加食物。經處理后的網籠、培養(yǎng)皿均轉入到25℃、RH 80%的人工氣候箱內培養(yǎng)觀察。培養(yǎng)24 h后觀察，成蟲能正?；顒佑洖榇婊?，幼蟲用毛筆輕觸有反應視為存活。蛹可發(fā)育到下一蟲態(tài)，視為存活，卵可孵化成幼蟲視為存活。記錄卵的孵化情況、幼蟲的存活情況、蛹的羽化情況和成蟲存活情況。計算各蟲態(tài)的死亡率和校正死亡率。校正死亡率的計算公式如下(張等宏等，2016)：

死亡率(%)﹦死亡蟲數(shù)/供試蟲數(shù)× 100

校正死亡率(%)=(處理組死亡率-對照組死亡率)/(100-對照組死亡率)× 100

1.6 供試化合物對雙額巖小糞蠅幼蟲的毒力

采用噴霧法測試植物精油單組分化合物對雙額巖小糞蠅幼蟲的毒力。在直徑70 mm的培養(yǎng)皿內，皿內鋪有濾紙保濕，用毛筆每皿接入20頭雙額巖小糞蠅幼蟲，取2 mL 5個不同劑量(625 mg/L、1 250 mg/L、2 500 mg/L、5 000 mg/L、10 000 mg/L、20 000 mg/L)的精油乳化液噴霧處理，對照組噴2 mL的1 000 mg/L吐溫水溶液。處理后添加草菇培養(yǎng)料，培養(yǎng)皿轉入到25℃、RH 80%的人工氣候箱內培養(yǎng)觀察。處理24 h后記錄幼蟲死亡數(shù)目，幼蟲用毛筆輕觸有反應視為存活。統(tǒng)計幼蟲死亡率，并求出毒力回歸方程。

1.7 供試化合物對雙額巖小糞蠅田間(草菇生產現(xiàn)場)產卵驅避試驗

選擇在室內對雙額巖小糞蠅產卵驅避效果明顯的植物精油單組分化合物進行田間(草菇生產現(xiàn)場)產卵驅避效果考察，田間試驗在廣州白云區(qū)人和鎮(zhèn)東坤草菇栽培場進行，采用非選擇性產卵驅避率法(黎卓維等，2007)，處理組的塑料盒(17 cm×12 cm×5 cm)裝300 g草菇培養(yǎng)料，用5 mL 5個不同濃度(625 mg/L、1 250 mg/L、2 500 mg/L、5 000 mg/L、10 000 mg/L、20 000 mg/L)的精油乳化液噴霧處理，對照組噴施5 mL的1 000 mg/L的吐溫水溶液。每處理4盒，每處理取2盒放置于草菇培養(yǎng)料預處理堆漚物區(qū)，另外2盒放置于菇房門口，各處理組和對照組成對放置在相同試驗區(qū)內。24 h后調查產卵量。5點取樣草菇培養(yǎng)基表層(層厚<2 cm)，將所取樣品混合后稱取50 g培養(yǎng)基，用20倍放大鏡來調查草菇培養(yǎng)料里面的產卵數(shù)。每個處理5次重復。評價供試化合物對雙額巖小糞蠅產卵的驅避作用。產卵驅避效果的計算公式為：

非選擇性產卵驅避率(%)= [(C - T)/C]×100。式中，C為對照組卵量，T為處理組卵量。

1.8 數(shù)據(jù)處理方法

應用SPSS 24.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，多組間均數(shù)比較采用ANOVA分析，多重比較采用R-E-G-W Q分析法，對照與處理之間的差異顯著性采用成對樣本T檢驗方法進行比較。毒力測定用Probit模塊(概率單位回歸)求出毒力回歸線。顯著性差異水平為P﹤0.05。

2 結果與分析

2.1 14種植物精油單組分對雙額巖小糞蠅產卵的影響

14種植物精油單組分化合物在濃度10 000 mg/L時對雙額巖小糞蠅產卵驅避測定結果表明(表1)：經α-松油醇、丁香酚和茴香醛處理后，雙額巖小糞蠅雌蟲的產卵量均顯著低于對照(P<0.05)，產卵驅避率分別是60.17%±9.57%、51.07%±2.63%和47.66%±7.10%；經月桂烯、α-蒎烯、β-蒎烯和異松油烯處理后，雙額巖小糞蠅雌蟲的產卵量與對照比較，產卵驅避率分別為-1.32%±3.91%、-2.41%±4.44%、-3.16%±6.55%和-3.15%±4.15%，差異不顯著(P﹥0.05)。

2.2 α-松油醇、丁香酚和茴香醛對雙額巖小糞蠅各蟲態(tài)的毒性試驗

根據(jù)2.1的結果，本實驗選擇α-松油醇、丁香酚和茴香醛這3種化合物對雙額巖小糞蠅各蟲態(tài)進行毒性測定。經過10 000 mg/L α-松油醇、丁香酚和茴香醛處理后的雙額巖小糞蠅各蟲態(tài)的毒性試驗結果表明(表2)：α-松油醇對雙額巖小糞蠅幼蟲的校正死亡率為5.11%±3.54%，與對照比差異達到顯著(P﹤0.05)，卵、蛹、成蟲則均差異不顯著(P﹥0.05)。丁香酚對雙額巖小糞蠅幼蟲、卵、蛹的校正死亡率分別為42.68%±3.94%、19.65%±7.09%、16.76%±4.83%，與對照比均達到極顯著(P﹤0.01)，對成蟲的校正死亡率為8.44%±5.05%，與對照比達到顯著(P﹤0.05)。茴香醛對雙額巖小糞蠅幼蟲的校正死亡率為14.47%±6.92%，與對照比達到極顯著(P﹤0.01)，對卵的校正死亡率為8.16%±4.34%，與對照比達到顯著(P﹤0.05)，蛹、成蟲則均差異不顯著(P﹥0.05)。

2.3 α-松油醇、丁香酚和茴香醛對雙額巖小糞蠅幼蟲的毒力

根據(jù)2.2的結果，3種精油對雙額巖小糞蠅各蟲態(tài)校正死亡率與對照比較均達到顯著的蟲態(tài)是幼蟲，因而本實驗的精油毒力試驗，選擇雙額巖小糞蠅幼蟲。3種精油對雙額巖小糞蠅幼蟲的毒力回歸方程和LC50結果表明(表3)：丁香酚對雙額巖小糞蠅幼蟲的毒力最大，LC50為16 965.159 mg/L。其次是茴香醛，LC50為311 941.332 mg/L。α-松油醇毒力最差，LC50為40 676 080.550 mg/L。

2.4 α-松油醇、丁香酚和茴香醛對雙額巖小糞蠅的田間產卵驅避效果

植物精油單組分化合物α-松油醇、丁香酚和茴香醛對雙額巖小糞蠅的田間產卵驅避效果表明(圖1)：α-松油醇、丁香酚和茴香醛對雙額巖小糞蠅產卵驅避率隨著濃度的增加呈現(xiàn)出顯著的正相關性，濃度越高，產卵驅避效果越好。其中，20 000 mg/L α-松油醇產卵驅避率可達69.75%±3.98%，20 000 mg/L丁香酚可達60.75%±1.94%，20 000 mg/L茴香醛則達57.23%±3.38%。

表1 各植物精油單組分化合物在濃度10 000 mg/L時對雙額巖小糞蠅產卵的影響(選擇性試驗)

注：表中數(shù)據(jù)為平均產卵數(shù)±標準差(n=5)；*表示對照與處理之間存在顯著差異(P<0.05)；**表示對照與處理之間存在極顯著差異(P<0.01)。Note: Values are the means±SD (n=5);*and**indicate a significant difference between treatment and the control atP<0.05 andP<0.01, respectively.

表2 10 000 mg/L α-松油醇、丁香酚和茴香醛處理對雙額巖小糞蠅各蟲態(tài)的毒性

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差(n=5)；*表示對照與處理之間存在顯著差異(P<0.05)；**表示對照與處理之間存在極顯著差異(P<0.01)。Note: Values are the means±SD (n=5);*and**indicate a significant difference between treatment and the control atP<0.05 andP<0.01, respectively.

表3 α-松油醇、丁香酚和茴香醛對雙額巖小糞蠅幼蟲的毒力

圖1 α-松油醇、丁香酚和茴香醛系列濃度對雙額巖小糞蠅成蟲的田間產卵驅避率(非選擇性試驗)Fig.1 Oviposition deterrent rate of α-Terpineol, eugenol, and p-Anisaldehyde against adult Bifronsina bifrons (Stenhammar) in the field (nonselective test)注：不同小寫字母者，表示在P<0.05存在顯著差異。Note: Different lowercase letters indicate a significant difference at P<0.05.

3 結論與討論

植物精油因具有對人、畜安全、作用方式新穎和不污染環(huán)境等優(yōu)點而備受關注。關于植物精油對多種植食性昆蟲驅避、拒食、熏蒸和毒殺活性的研究也有許多文獻報道(徐漢虹和趙善歡，1995；呂建華等，2006；黎卓維等，2007；丁玉軍等，2009；邊文波等，2012)，但植物精油單組分對雙額巖小糞蠅作用活性的研究還鮮見報道。吳華等(2019)報道了三角瓶密閉熏蒸法測試月桂烯、α-蒎烯、異松油烯3種植物精油對雙額巖小糞蠅的熏殺、擊倒作用及其混配增效作用。本研究發(fā)現(xiàn)在開放環(huán)境里，月桂烯、α-蒎烯、β-蒎烯、異松油烯對雙額巖小糞蠅的產卵驅避作用不明顯。研究發(fā)現(xiàn)α-松油醇、丁香酚和茴香醛，無論是室內選擇性試驗還是田間非選擇性試驗，對雙額巖小糞蠅成蟲均具有明顯的產卵驅避效果，且隨著α-松油醇、丁香酚和茴香醛濃度的增加其產卵驅避效果顯著增加。

據(jù)報道，芳樟醇、香葉醇、檸檬醛對白紋伊蚊Aedesalbopictus和德國小蠊Blattellagermanica雄性成蟲有驅避作用(郝蕙玲等，2008；林永麗等，2008；邵明輝等，2015)，檸檬烯對松小蠹Dendroctonusbrevicomis有驅避作用(徐漢虹和趙善歡，1994)，迷迭香揮發(fā)物中β-石竹烯明顯地驅避茶樹害蟲假眼小綠葉蟬Empoascavitis(Gothe)(鈕羽群等，2015)。但本研究的室內試驗結果表明，芳樟醇、β-石竹烯、香葉醇、檸檬烯、檸檬醛對雙額巖小糞蠅無驅避活性。

本研究表明α-松油醇對草菇主要害蟲雙額巖小糞蠅有驅避活性，而文獻報道α-松油醇對草菇的另一種害蟲平菇厲眼蕈蚊Lycoriellapleuroti也有驅避活性(吳華等，2018)。證明α-松油醇可兼治草菇的兩種害蟲，可作為防治草菇害蟲的一種基礎性的精油成分。α-松油醇、丁香酚和茴香醛不僅能驅避雙額巖小糞蠅，還能驅避白蚊伊蚊(郝蕙玲和杜家緯，2008；邵明輝等，2015)。且茴香醛對德國小蠊雄性成蟲也有驅避性(林永麗等，2008)。大量研究表明，植物精油對昆蟲有驅避、引誘、熏蒸、毒殺和抑制害蟲生長發(fā)育作用。本研究發(fā)現(xiàn)丁香酚對雙額巖小糞蠅卵、幼蟲、蛹和成蟲均具有一定的毒殺作用，α-松油醇對幼蟲、茴香醛對卵、幼蟲也具有一定的毒殺作用。草菇雙額巖小糞蠅發(fā)生數(shù)量最多的是在草菇培養(yǎng)料預處理堆漚物上，大量雙額巖小糞蠅在預處理堆漚物上面產卵并隨著培養(yǎng)基料帶進草菇房里面危害(歐劍峰等，2009)，并且產卵期很短，通常在12～24 h孵化(劉桂清等，2009)?？筛鶕?jù)雙額巖小糞蠅危害的特點，有針對性地將這3種精油噴施在草菇的培養(yǎng)料預處理堆漚物上，既可以驅避雙額巖小糞蠅來預處理堆漚物上產卵，又可以對已經產卵在預處理堆漚物上并孵出的幼蟲產生一定的毒殺作用，達到事半功倍的防治效果。