右旋糖酐酶解條件研究

問清江， 慕 娟，鄭巧霞，孫曉宇，丁 浩

( 陜西省微生物研究所， 陜西 西安 710043)

右旋糖酐(Dextran)是主要由α-(1,6)糖苷鍵連接而成的葡聚糖，是腸膜狀明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)產生的胞外多糖[1]。右旋糖酐因其具有安全、無毒、生物相容性好等多種優(yōu)點，已被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、色譜分析等多個領域[2]。醫(yī)藥的主要用途為血漿代用品，其具有具有增加血容量、改善微循環(huán)、防止彌散性血管內凝血的作用，主要用于治療失血性休克，臨床上應用的常有3種規(guī)格產品：右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20[3～5]。藥用右旋糖酐的傳統(tǒng)生產為，蔗糖經腸膜狀明串珠菌發(fā)酵轉化而成分子量巨大的右旋糖酐，經鹽酸水解為一定分子量分布的低分子右旋糖酐，分離純化為目標右旋糖酐。右旋糖酐酶(Dextranase，EC 3.2.1.11)能夠催化水解右旋糖酐(Dextran)分子中的α-1,6葡萄糖苷鍵，降解為小分子的右旋糖酐、異麥芽糖、異麥芽三糖、葡萄糖及少量的多聚糖。右旋糖酐酶水解右旋糖酐，具有專一性和高效性，可以提高水解效率；酶的底物特異性顯示酶的親和力隨底物分子量的增加而增強，尤其是對分子量1 000萬以上的右旋糖酐的親和力遠遠大于100萬以下的右旋糖酐，這一特點有益于改善水解物的分子量分布[6]；水解反應條件溫和，既可避免鹽酸水解設備的特殊要求，又可以降低能耗?？傊畬⒂倚囚该附庥倚囚糜谟倚囚纤幍纳a，可以提高產率、改善產品品質。在先期右旋糖酐酶酶學性質研究基礎之上進一步進行酶解條件研究，通過酶濃度、右旋糖酐濃度、溫度、時間等酶解條件及酶解液后處理等工藝條件研究，以利于改進右旋糖酐原料藥生產技術和提升產品品質。

1 材料和方法

1.1 材料

(1)右旋糖酐酶(寧夏夏圣實業(yè)集團有限公司)。

(2)試劑：葡萄糖(D-(+)-Glucose),Sigma 公司產品；蔗糖(AR)，3,5-二硝基水楊酸(CP)；其他試劑為市售分析純。

(3) 粗酐(陜西省微生物研究所自制)。

(4)儀器。722分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；85-2數顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機有限公司)；101型電熱鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)； 2010A-HT高效液相色譜儀(蘇州貝銳儀器科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖酐酶濃度對右旋糖酐酶解的影響 分別以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 IU·mL-1不同酶濃度，在溫度50℃，時間2.5 h，粗酐濃度6%條件下酶解右旋糖酐。間隔30 min取樣測定葡萄糖含量及分子量分布，水解結束后酶解液用乙醇沉淀、50℃烘干為干品，干品測定分子量分布。

1.2.2 pH對右旋糖酐酶解的影響 分別在pH4.0、4.6、5.0、5.4、6.0不同pH條件下酶解右旋糖酐，溫度50℃，酶濃度0.3 IU·mL-1，時間2.5 h，粗酐濃度6%。間隔30 min取樣測定葡萄糖含量及分子量分布，水解結束后酶解液用乙醇沉淀、50℃烘干為干品，干品測定分子量分布。

1.2.3 右旋糖酐濃度對右旋糖酐酶解的影響 選取右旋糖酐濃度為4%、5%、6%、7%、8%，在酶濃度0.3 IU·mL-1，pH5.0，溫度50℃，時間2.5 h條件下進行酶解。間隔30 min取樣測定葡萄糖含量及分子量分布，水解結束后酶解液用乙醇沉淀、50℃烘干為干品，干品測定分子量分布。

1.2.4 溫度對右旋糖酐酶解的影響 分別在40、45、5.0、55、60℃不同溫度下酶解右旋糖酐，酶濃度0.3 IU·mL-1，pH5.0，溫度50℃，時間2.5 h，粗酐濃度6%。間隔30 min取樣測定葡萄糖含量及分子量分布，水解結束后酶解液用乙醇沉淀、50℃烘干為干品，干品測定分子量分布。

1.2.5 還原糖測定(以葡萄糖糖計)[7]采用DNS法測定葡萄糖糖。葡萄糖糖標準曲線繪制：配制1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液，分別量取0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL葡萄糖標準溶液，用蒸餾水補齊1.0 mL，再加入2.0 mLDNS，沸水浴2 min，冷水浴水冷卻后加蒸餾水至10 mL，在540 nm進行光吸收測定，繪制葡萄糖糖標準曲線，得出回歸方程用于葡萄糖的測定。

酶解液等樣品稀釋一定倍數，取樣品1.0 mL加入2.0 mL DNS煮沸2 min顯色，然后冷水浴冷卻至室溫，定容至10.0 mL，以蒸餾水為對照，540 nm測定吸光值，根據回歸方程得出樣品中的葡萄糖糖含量。

葡萄糖糖含量算公式：

葡萄糖(mg·mL-1)=[(Ae-A0) + 0.1182]/1.614×Df

式中：Ae——樣品的吸光值

A0—蒸餾水空白的吸光值

Df—樣品的稀釋倍數

1.2.6 分子量與分子量分布[8]取樣品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含10 mg的溶液，振搖，室溫放置過夜作為供試品溶液。另取4～5個已知分子量的右旋糖酐對照品，依法檢查(2015版《藥典》二部附錄VH)，樣品10%大分子部分重均分子量不得大于120 000，10%小分子部分重均分子量不得小于5 000。

2 結果與分析

2.1 右旋糖酐酶濃度對右旋糖酐酶解的影響

不同右旋糖酐酶濃度下右旋糖酐水解過程中的還原糖和重均分子量變化及酶解結果見圖2～圖5。各種酶濃度下的還原糖隨時間的增加而增大，在同一時間點還原糖和還原糖增加趨勢隨酶濃度的增加而增大，原因在于，打開糖苷鍵就會產生還原端，酶濃度越高酶解效率越高，產生的還原端越多。酶解進程中重均分子量總體呈現出逐漸降低的趨勢，0.1 IU·mL-1酶濃度和其余酶濃度的重均分子量變化趨勢略有不同，前者在初始時段降低較慢，后者在初始階段降低較快，這是酶解液中酶量的大小所致。不同酶濃度下的酶解產物的重均分子量隨酶濃度的增加而降低，0.1 IU·mL-1酶濃度產物的重均分子量在10 000以上，其余均低于10 000。

2.2 pH對右旋糖酐酶解的影響

在不同pH條件下酶解右旋糖酐， pH4.6、pH5.0和pH5.4的還原糖隨著酶解時間的延長呈現明顯的上升趨勢，而pH4.0和pH6.0的還原糖變化呈現水平狀態(tài)(見圖6)。原因在于該右旋糖酐酶的最適反應pH值是pH5.0[6]，pH4.6和pH5.4接近pH5.0，對右旋糖酐的酶解影響不大，pH5.0的酶解最好，其次是pH4.6和pH5.4；而pH4.0和pH6.0遠離pH5.0，酶解效果很差。在不同pH下右旋糖酐酶解進程中重均分子量變化趨勢呈現降低趨勢(見圖7～圖8)，降低的幅度和還原糖增加的幅度一致。不同pH的右旋糖酐酶解結果見圖9，pH4.0和pH6.0的重均分子量在200 000以上，pH4.6、pH5.0和pH5.4的重均分子量在10 000以下，pH5.0的最低。根據以上結果，右旋糖酐酶解的pH為pH4.6～5.4，pH5.0最佳。

2.3 右旋糖酐濃度對右旋糖酐酶解的影響

在其他酶解條件相同的情況下，不同濃度右旋糖酐酶解進程中的還原糖和重均分子量變化及酶解結果見圖10～圖12。還原糖隨時間的變化均呈現增加趨勢，同一時間點，還原糖基本隨右旋糖酐濃度的增加而增加。重均分子量均隨酶解時間的延長呈下降趨勢，同一時間點重均分子量隨右旋糖酐濃度的增加而下降。水解產物的重均分子量隨右旋糖酐濃度的增加而增加，4.0%～7.0%增幅相近，8.0%比7.0%增加幅度較大。在右旋糖酐酶解時，底物濃度的可選擇擇范圍較廣。

2.4 溫度對右旋糖酐酶解的影響

不同溫度條件下酶解右旋糖酐，還原糖和重均分子量隨時間變化及酶解結果見圖13～圖16。45℃、50℃、55℃還原糖隨時間的變化趨勢基本一致，呈現上升趨勢；40℃也呈現上升趨勢，只是增加的趨緩；60℃基本是一條水平線，還原糖隨時間變化甚微。重均分子量的變化表現為45℃、50℃、55℃呈現相似的下降趨勢，40℃下降趨緩，60℃基本水平。酶解結果表明，40℃的產物重均分子量為10 000以上，45℃、50℃、55℃的在5 000～7 000，60℃的在200 000以上。該右旋糖酐酶的最適作用溫度為55℃，50℃以下相對穩(wěn)定[6]，40℃酶解右旋糖酐發(fā)硬速率較低，45～55℃之間反應速率快，60℃酶失活，這些就是造成以上結果的主要原因。在選擇右旋糖酐酶解溫度時，既要考慮反應速率，也要考慮酶的熱穩(wěn)定性，所以將酶解溫度定于45～55℃，最好在50℃。

2.5 右旋糖酐酶解制備右旋糖酐40

右旋糖酐酶水解右旋糖酐制備右旋糖酐40，產品的分子量分布均已達到中國藥典右旋糖酐40產品標準，重均分子量35 000以上，10%小分子大于7 000，二者均已已提高到BP2012(EPS)標準[9]，大大提升了了產品質量，產品收率最高可達35%以上。

表1 右旋糖酐40制備結果

3 討論

右旋糖酐酶濃度為0.1 IU·mL-1時，酶解產物的重均分子量在10 000以上，因此運用該右旋糖酐酶酶解制備醫(yī)用右旋糖酐時，酶濃度應該選擇在0.1 IU·mL-1以下。該酶最適反應pH值是pH5.0[6]，pH4.6和pH5.4接近pH5.0，對右旋糖酐的酶解影響不大，pH5.0的酶解最好，其次是pH4.6和pH5.4；而pH4.0和pH6.0遠離pH5.0，酶解效果很差，右旋糖酐酶解的pH為pH4.6～5.4，pH5.0最佳。水解產物的重均分子量隨右旋糖酐濃度的增加而增加，4.0%～7.0%增幅相近，8.0%比7.0%增加幅度較大，在右旋糖酐酶解時，底物濃度的可選擇擇范圍較廣。該右旋糖酐酶的最適作用溫度為55℃，50℃以下相對穩(wěn)定[6]，40℃酶解右旋糖酐發(fā)硬速率較低，45～55℃之間反應速率快，60℃酶失活，在選擇右旋糖酐酶解溫度時，既要考慮反應速率，也要考慮酶的熱穩(wěn)定性，所以將酶解溫度定于45～55℃，最好在50℃。在應用右旋糖酐酶酶解右旋糖酐時，既要考慮以上幾個因素，還要和具體標的物的分子量分布要求、右旋糖酐的狀態(tài)(發(fā)酵液，乙醇提取粗酐，膜分離粗酐。)等因素相結合，進一步選擇合適的酶濃度、溫度、底物濃度、pH值、酶解時間等條件。右旋糖酐酶水解右旋糖酐制備右旋糖酐40，產品的分子量分布均已達到中國藥典右旋糖酐40產品標準，重均分子量35 000以上，10%小分子大于7 000，二者均已提高到BP2012(EPS)標準[9]，大大提升了產品質量，產品收率最高可達35%以上。以右旋糖酐酶酶解右旋糖酐代替鹽酸水解，優(yōu)化水解工藝，提升產品品質，提高生產效率，降低企業(yè)環(huán)保負荷。右旋糖酐酶解條件的研究只是一個初步探索，要用右旋糖酐酶酶解右旋糖酐代替鹽酸水解制備右旋糖酐40等醫(yī)用右旋糖酐實現產業(yè)化，還需要進一步的工藝條件研究。