豬瘟檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

但蕊桐 李虹霓 許靜 黃蘭香

摘 要：豬瘟是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 （OIE） 列出的16種A類傳染病之一，我國(guó)也將其列為一類動(dòng)物疫病。本病致死性及傳染性極強(qiáng)，在給生豬產(chǎn)業(yè)造成巨大沖擊、影響群眾生活的同時(shí)，也給我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)和國(guó)際貿(mào)易造成巨大損失， 因此無論政府還是生豬養(yǎng)殖企業(yè)都一直把對(duì)豬瘟及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)作為保證生豬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的手段之一。本文作者通過查閱大量文獻(xiàn)資料，總結(jié)歸納了豬瘟檢測(cè)技術(shù)方面的發(fā)展現(xiàn)狀，以期為豬瘟高效準(zhǔn)確的檢測(cè)提供技術(shù)參考，為豬瘟的有效防控提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬瘟;檢測(cè);技術(shù)

豬瘟（CSF）是由黃病毒科瘟病毒屬的有囊膜的單股正鏈RNA豬瘟病毒（CSFV）[1]引起的高度接觸性、出血性豬傳染病。至今已經(jīng)流行了70多年，是我國(guó)四大動(dòng)物疫病之一。其主要流行特點(diǎn)是流行范圍廣，流行沒有明顯的季節(jié)性，發(fā)病豬年齡普遍較小，仔豬是主要的發(fā)病群體[2]。近年來豬瘟發(fā)病時(shí)的病癥更加溫和但發(fā)病持續(xù)時(shí)間較以往變得更長(zhǎng)， 表現(xiàn)出持續(xù)性感染和混合感染[3]。目前已知的豬瘟病癥在臨床上可分為最急性型，急性型，慢性型，溫和型[4]。我國(guó)自新中國(guó)建立以來就一直重視豬瘟的防控工作，在這方面積累了相當(dāng)?shù)慕?jīng)驗(yàn)，但通過疫苗接種控制豬瘟的策略近年來一直沒有達(dá)到理想的效果，在這種情況下，掌握敏感、高效、準(zhǔn)確的豬瘟檢測(cè)技術(shù)尤為重要。本文就現(xiàn)有的豬瘟檢測(cè)技術(shù)種類及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述，為豬瘟的診斷技術(shù)提供參考。

1.分子生物學(xué)檢測(cè)

1.1 RT-LAMP

逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（RT-LAMP）是Notomi[5]等人在環(huán)介導(dǎo)等溫核擴(kuò)增技術(shù)基礎(chǔ)上衍生出的一種能夠檢測(cè)RNA病原的新型檢測(cè)技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單便捷，不需要精密的儀器和特殊的試劑。原理是在原始環(huán)介導(dǎo)等溫核擴(kuò)增反應(yīng)中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，通過對(duì)靶序列上的特異性引物和特殊DNA聚合酶的識(shí)別[6]從而對(duì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增[7]。自陳蕾[8]于2009年研制出豬瘟RT-LAMP試劑盒，近年來RT-LAMP技術(shù)在豬瘟檢測(cè)領(lǐng)域被廣泛運(yùn)用。曾小娜[9]等人的研究結(jié)果顯示此方法靈敏度高達(dá)10-5， 最低能檢測(cè)到1pg的RNA，反應(yīng)快速可在1h內(nèi)完成。且通過實(shí)驗(yàn)可知RT-LAMP方法的靈敏度是RT-PCR的100倍，進(jìn)一步證明了RT-LAMP方法的優(yōu)越性。

1.2 RT-PCR

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是對(duì)病毒特異性基因進(jìn)行擴(kuò)增從而達(dá)到檢測(cè)目的。其優(yōu)點(diǎn)是特異性好，敏感性高。波丹、黃憲高等人[10]于2000年對(duì)此方法進(jìn)行了初探。RT-PCR可以擴(kuò)增病毒的特異性核酸片段，從而解決豬瘟病毒和同屬病毒在血清學(xué)檢測(cè)中難以辨別的問題。初步肯定了RT-PCR特異性高的優(yōu)點(diǎn)。后來的研究發(fā)現(xiàn)RT-PCR技術(shù)最低能檢測(cè)到100 pg微量的豬瘟病毒核酸[11]，進(jìn)一步肯定了RT-PCR敏感性好的優(yōu)點(diǎn)。陳創(chuàng)夫[12]等人采用了多種檢測(cè)方法對(duì)9份豬瘟病料進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，用RT-PCR法檢測(cè)出的陽(yáng)性率最高。但由于此方法對(duì)儀器和操作人員要求較高，需要高精確度 PCR 儀和裝備良好的實(shí)驗(yàn)室條件，故對(duì)于基層檢測(cè)難以開展。

1.3熒光定量RT-PCR

熒光定量RT-PCR法的原理與普通的RT-PCR檢測(cè)大同小異，只是在其檢測(cè)過程中引入了熒光染料作為標(biāo)記，再通過熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增[13]。雖然原理類似，但因?yàn)橛辛藷晒馊玖系募尤?，使?duì)目的擴(kuò)增片段的識(shí)別更敏感、特異性更強(qiáng)，過程更迅速，結(jié)果更明顯。國(guó)外很早就將該法運(yùn)用于豬瘟的定量檢測(cè)中[1]。余以剛黃韻[14]等人用熒光定量PCR的方法分別鑒別野毒株和疫苗株，其靈敏度達(dá)到1TCID50/mL和0.1TCID50/mL，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均在0.7-2.2%之間，以上結(jié)果均顯示優(yōu)于普通RT-PCR。王淑娟[15]等人用已知的35份疑似豬瘟病毒感染樣品，通過普通RT-PCR法檢出的陽(yáng)性數(shù)量為21份，采用熒光定量RT-PCR法則檢出23份陽(yáng)性，可知此方法檢出率更高。

1.4重組酶聚合酶擴(kuò)增

重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測(cè)是由英國(guó)劍橋的NiallArmes等人[16]于2006年開發(fā)的一種可快速檢測(cè)的新型等溫核酸擴(kuò)增方法，是近年來常用的豬瘟檢測(cè)技術(shù)。其基本原理是依靠一種能產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)活性的DNA代謝反應(yīng)。所用引物寡核苷酸在重組酶的作用下插入和結(jié)合于DNA雙鏈互補(bǔ)序列中，再以類似于PCR的方式對(duì)DNA的特定區(qū)域進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增[17]。該法對(duì)于反應(yīng)溫度、設(shè)備的要求較低，從而能更大限度的減少成本。且在低成本的前提下，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)也更短，5-30min內(nèi)即可完成，靈敏度和特異性也相對(duì)更優(yōu)[18]。根據(jù)王金鳳等人[19]的研究結(jié)果顯示，所建立的RT-RPA方法僅對(duì)豬瘟病毒有特異性擴(kuò)增條帶，而對(duì)其他豬常見病原沒有特異性擴(kuò)增結(jié)果。在57份臨床樣品的檢測(cè)中，RT-RPA方法的陽(yáng)性檢出率為56.14%（32/57），而實(shí)時(shí)RT-PCR方法的檢出率為64.91%（37/57）。但由于至今仍然沒有專門用于RPA引物設(shè)計(jì)的軟件，只能靠大量的合成與篩選，在這方面的成本和時(shí)間消耗很大，有時(shí)甚至無法設(shè)計(jì)出理想的引物與探針，故該法的普及也有待進(jìn)一步的研究發(fā)展。

2.免疫學(xué)檢測(cè)

2.1膠體金免疫層析抗體檢測(cè)

膠體金免疫層析技術(shù)是一種問世不久的能在體外進(jìn)行的檢測(cè)技術(shù)，是在膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)共同基礎(chǔ)上所創(chuàng)立[20]。一般可以分為兩大類[21]，其中GICA由于膠體金制備簡(jiǎn)便，標(biāo)記簡(jiǎn)單純化也不復(fù)雜[22]。故自發(fā)現(xiàn)以來就得到了廣泛的應(yīng)用。其主要原理是抗原抗體在固相膜上反應(yīng)，然后用膠體金標(biāo)記過的抗體進(jìn)行顯色反應(yīng)，來判斷是不是陽(yáng)性。2004年姜建宏，周艷君等人[23]發(fā)現(xiàn)與ELISA相比， 膠體金免疫層析技術(shù)對(duì)人體危害小。王向鵬等人[20]對(duì)六種豬瘟診斷方法進(jìn)行研究比較，選擇50 份樣品進(jìn)行膠體金檢測(cè)，被檢測(cè)出的陽(yáng)性占其中的16%，但病毒分離方法檢測(cè)出的陽(yáng)性數(shù)量更多。說明其敏感性不足，故主要用于對(duì)畜群進(jìn)行檢測(cè)，不適合個(gè)體檢測(cè)。

2.2雙抗體夾心ELISA

雙抗體夾心ELISA法是目前最常用的檢測(cè)豬瘟抗原的檢測(cè)方法之一，其原理是特異性抗體與待檢血清中的抗原，在固相載體上結(jié)合形成免疫復(fù)合物。洗去未結(jié)合的樣品之后加入酶標(biāo)記抗體，與免疫復(fù)合物中的抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物，再在酶反應(yīng)底物的催化下反應(yīng)，最后通過顯色反應(yīng)，從而判斷抗原含量。湯賽冬，周雪芳等人[24]建立的夾心ELISA檢測(cè)方法，經(jīng)過特異性和重復(fù)性的檢驗(yàn)得出陽(yáng)性結(jié)果符合率高達(dá)97.7%的結(jié)果。從而說明該方法有較好的特異性。雙抗夾心ELISA的豬瘟抗原檢測(cè)方法可直接檢測(cè)豬瘟病毒，對(duì)早中期的檢測(cè)都具有優(yōu)勢(shì)[22]。該檢測(cè)方法不僅可以檢測(cè)新鮮組織和組織細(xì)胞培養(yǎng)物，而且對(duì)于檢測(cè)大批量的活動(dòng)物血液樣品也極為適用，所以可運(yùn)用于出入境檢驗(yàn)檢疫[25]。但此方法操作時(shí)間較長(zhǎng)（兩天），具有一定局限性[26]。

2.3 IPMA檢測(cè)方法

免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）其原理是在單層細(xì)胞中加入一抗和帶有HRP（辣根過氧化物酶）的二抗，最后再加入促進(jìn)顯色反應(yīng)的酶，通過光學(xué)顯微鏡觀察是否有特異性顯色反應(yīng)來判斷陽(yáng)性與否。根據(jù)張振倉(cāng)魏麗娜等人[27]建立的豬瘟病毒IPMA檢測(cè)方法 的結(jié)果顯示，IPMA與RT-PCR和ELISA陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果符合率均可達(dá)92%以上。且由譚斌[28]等人針對(duì)高致病性豬藍(lán)耳病毒發(fā)明的IPMA抗體檢測(cè)試劑盒也與其他病毒的參考血清無交叉反應(yīng)，說明IPMA法具有良好的特異性和可靠性。但由于此方法得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易受到個(gè)人主觀因素的影響，故并未廣泛應(yīng)用。

3.結(jié)語(yǔ)

豬瘟作為世界各國(guó)重點(diǎn)關(guān)注和控制的豬的傳染病之一，對(duì)我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)影響極大，故自此病被首次發(fā)現(xiàn)以來，其檢測(cè)方法的研究一直為國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界所關(guān)注，并成為一大研究熱點(diǎn)。目前關(guān)于豬瘟的檢測(cè)方法的研究呈現(xiàn)出良好的成果，已有的檢測(cè)技術(shù)對(duì)豬瘟的防控做出了巨大的貢獻(xiàn)。但不可否認(rèn)的是這些檢測(cè)技術(shù)依舊存在一些局限性，目前廣泛用于豬瘟檢測(cè)的方法，普遍不能完全滿足快捷方便，特異型敏感性良好，耗材低廉的需求。近年來得益于國(guó)內(nèi)外研究人員的努力，不少新型檢測(cè)方式逐步被建立創(chuàng)造出來，對(duì)豬瘟的檢測(cè)研究呈現(xiàn)出良好態(tài)勢(shì)。我們相信在未來會(huì)不斷涌現(xiàn)出更多滿足以上人們需求并能廣泛推廣于基層中的檢測(cè)方法。

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作者簡(jiǎn)介：

但蕊桐（1999-），女（漢族），重慶市渝北區(qū)人，本科生，動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)

李虹霓（2000-），女（漢族），重慶市沙坪壩區(qū)人，本科生，動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)

許靜（1997-），女（漢族），云南省蒙自市人，本科生，動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)

黃蘭香（1972-），女（漢族），湖南常德人，博士，任職于西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，副教授，研究方向：主要從事動(dòng)物微生物學(xué)與免疫學(xué)的教學(xué)科研工作。

資助項(xiàng)目： 西南大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（X201910635040）