RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶在肺腺癌中的表達(dá)及意義

趙琦　相綠竹　彭瑞　王曄　牟曉峰

[摘要]目的 比較人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和正常人肺上皮細(xì)胞系BEAS-2b、肺腺癌和癌旁組織中RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。方法 分別采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）和蛋白免疫印跡（Western blot）方法檢測A549和BEAS-2b細(xì)胞中RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶mRNA及蛋白的表達(dá)水平;采用免疫組化法（IHC）檢測肺腺癌與癌旁組織中RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。結(jié)果RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與BEAS-2b細(xì)胞相比，A549細(xì)胞中甲基化轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3（METTL3）mRNA的表達(dá)水平顯著上升（t=5.708，P<0.05），而甲基化轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14（METTL14）和腎母細(xì)胞瘤1相關(guān)蛋白（WTAP）mRNA的表達(dá)水平顯著下降（t=24.080、9.207，P<0.05）。Wes-tern blot檢測顯示，與BEAS-2b細(xì)胞相比，A549細(xì)胞中METTL3、METTL14蛋白的表達(dá)水平均顯著上升（t=6.502、6.869，P<0.05），而WTAP蛋白的表達(dá)水平顯著下降（t=8.822，P<0.05）。IHC檢測顯示，METTL3、METTL14定位于細(xì)胞核內(nèi)，肺腺癌組織中二者的表達(dá)水平較癌旁組織顯著升高（t=3.055、4.339，P<0.05）;WTAP定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，肺腺癌組織中其表達(dá)水平較癌旁組織顯著下降（t=3.611，P<0.05）。結(jié)論A549細(xì)胞和肺腺癌組織中RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)與BEAS-2b細(xì)胞及癌旁組織相比有明顯差異，提示可能存在某些依賴于N6-甲基腺嘌呤（m6A）修飾的機(jī)制影響肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 肺腫瘤;腺癌;tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶類

[中圖分類號] R734.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A[文章編號] 2096-5532（2020）04-0394-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.069[HT]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.1001.019.html;2020-04-18 16：17

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF RNA METHYLTRANSFERASE IN LUNG ADENOCARCINOMA

ZHAO Qi， XIANG Lüzhu， PENG Rui， WANG Ye， MU Xiaofeng

（Department of Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To compare the expression of RNA methyltransferase in human lung adenocarcinoma cell line A549 and normal human lung epithelial cell line BEAS-2b， as well as in lung adenocarcinoma and adjacent tissues. Methods Real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR） and Western blot were used to determine the expression levels of RNA methyltransferase mRNA and protein， respectively， in A549 and BEAS-2b cells. Immunohistochemistry （IHC） was used to localize and determine the expression of RNA methyltransferase in lung adenocarcinoma and adjacent tissues. Results RT-qPCR results showed that compared with BEAS-2b cells， A549 cells had a significantly higher mRNA expression level of methyltransferase-like protein 3 （METTL3） （t=5.708，P<0.05） and significantly lower mRNA expression levels of methyltransferase-like protein 14 （METTL14） and Wilms tumor 1-associating protein （WTAP） （t=24.080，9.207;P<0.05）. Western blot results showed that compared with BEAS-2b cells， A549 cells had significantly higher protein expression levels of METTL3 and METTL14 （t=6.502，6.869;P<0.05） and a significantly lower protein expression level of WTAP （t=8.822，P<0.05）. IHC results showed that METTL3 and METTL14 were localized in the nucleus， and their expression in lung adenocarcinoma tissues was signi-

ficantly higher than that in adjacent tissues （t=3.055，4.339;P<0.05）; WTAP was localized in the nucleus and cytoplasm， and its expression in lung adenocarcinoma tissues was significantly lower than that in adjacent tissues （t=3.611，P<0.05）. Conclusion Compared with BEAS-2b cells and adjacent tissues， A549 cells and lung adenocarcinoma tissues have significantly different RNA methyltransferase expression， suggesting that there may be some mechanisms that rely on N6-methyladenosine modification affec-ting the development and progression of lung adenocarcinoma.

[KEY WORDS] lung neoplasms; adenocarcinoma; tRNA methyltransferases

中國的癌癥發(fā)病率和死亡率逐年上升，據(jù)統(tǒng)計，2015年中國約有429.2萬例癌癥新發(fā)病例和281.4萬例癌癥死亡病例，肺癌是其中最為常見的一種癌癥，也是癌癥死亡的首要原因[1]。肺腺癌占所有肺癌的80%左右，且大多數(shù)肺腺癌病人在確診時已處于晚期階段，病人術(shù)后5年生存率較低[2]。目前，肺腺癌治療方式有手術(shù)、放化療以及靶向治療等，靶向治療以其精準(zhǔn)、高效的特點在癌癥治療中起到了越來越大的作用[3]。因此，發(fā)現(xiàn)并篩選新的肺腺癌有效的預(yù)后標(biāo)志物和潛在的治療靶點是目前研究的重要臨床課題之一。

N6-甲基腺嘌呤（m6A）修飾是真核細(xì)胞mRNA及非編碼RNA中最為豐富的表觀遺傳學(xué)修飾[4-5]，而且該修飾過程是動態(tài)、可逆的。目前普遍認(rèn)為，m6A修飾受3種蛋白調(diào)控，包括“讀寫器”、“消除器”及“閱讀器”。其中，“讀寫器”即“writers”，指RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，主要包括甲基化轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3（METTL3）、甲基化轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14（METTL14）以及腎母細(xì)胞瘤1相關(guān)蛋白（WTAP），它們的主要作用為促進(jìn)RNA的m6A修飾過程[6]。METTL3與METTL14具有43%的同源性，兩者常以復(fù)合體的形式發(fā)揮作用，其中METTL3主要作為催化核心，而METTL14主要作為RNA結(jié)合平臺發(fā)揮作用[7]。WTAP可與METTL3-METTL14復(fù)合物相互作用，影響細(xì)胞內(nèi)m6A的沉積[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌、結(jié)直腸癌、乳癌、肝癌、膀胱癌等[9-14]。但這3種RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶在肺癌中的作用機(jī)制還不十分清楚。因此，本研究采用多種方法，比較人肺腺癌細(xì)胞及正常人肺上皮細(xì)胞、人肺腺癌組織和癌旁組織中RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)差異，為探究m6A甲基化在肺癌發(fā)生中的作用機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞與組織 人肺腺癌細(xì)胞株A549和人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2b均購自上海歌凡生物科技有限公司。10對肺腺癌與癌旁組織（距離癌組織2 cm）標(biāo)本均來自青島市中心醫(yī)院病理科，取材自2016—2018年青島市中心醫(yī)院的肺癌手術(shù)病人。10例病人中，男6例，女4例;病人年齡54～64歲，平均58.7歲;腫瘤位于右肺6例，位于左肺4例;分化程度為中高分化3例，低分化7例;腫瘤最大徑為2～10 cm，平均4.7 cm;TNM分期為1A期2例，1B期1例，2B期1例，3A期5例，3B期1例。

1.1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清、RPMI 1640及DMEM培養(yǎng)基均購自美國Sigma公司;擴(kuò)增用ETTL3、METTL14、WTAP引物以及Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司;[LL]實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測試劑盒（SYBRSelect Master Mix）購自美國ABI公司;細(xì)胞裂解液RIPA、BCA蛋白檢測試劑盒、磷酸鹽緩沖液（PBS）及牛血清清蛋白（BSA）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒、蘇木精染液均購自北京索萊寶科技有限公司;METTL3、METTL14、WTAP、GAPDH一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗購自美國Abcam公司。熒光定量PCR儀購自美國ABI公司;電泳儀購自美國伯樂公司;光學(xué)顯微鏡購自德國蔡司公司;多功能分子成像系統(tǒng)購自美國Azure Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549、BEAS-2b細(xì)胞分別在含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)0.01青霉素-鏈霉素的RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。將處于指數(shù)生長期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以每孔6×105個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度約為90%時分別用Trizol和RIPA裂解液收取細(xì)胞。

1.2.2 RT-qPCR檢測RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶mRNA的表達(dá) 將Trizol法提取的A549、BEAS-2b細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA作為模板，分別應(yīng)用METTL3、METTL14、WTAP特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)體系10 μL，包括：1∶14稀釋的cDNA模板4.6 μL，上、下游引物各0.2 μL，Master Mix 5.0 μL。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。反應(yīng)條件：95 ℃熱啟動10 min;95 ℃、15 s，60 ℃、1 min（收集熒光信號），40個循環(huán)。反應(yīng)完成后根據(jù)Ct值計算目的基因的相對表達(dá)量。PCR擴(kuò)增所用引物及其序列見表1。

1.2.3 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶蛋白的表達(dá) 已處理的細(xì)胞加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。在120 g/L的聚丙烯酰胺凝膠中電泳后，于冰上轉(zhuǎn)至PVDF膜上。使用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗人或鼠抗人的METTL3、METTL14、WTAP一抗（稀釋度均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗（稀釋度均為1∶3 000），再加入GAPDH直標(biāo)抗體（稀釋度為1∶5 000），室溫孵育1 h，洗膜后顯影成像。以GAPDH為內(nèi)參照，計算METTL3、METTL14、WTAP的相對表達(dá)量。

1.2.4 免疫組化法（IHC）檢測肺腺癌及癌旁組織中RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá) 將10對肺腺癌與癌旁組織石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，放入體積分?jǐn)?shù)0.03的過氧化氫溶液中室溫避光孵育25 min，應(yīng)用PBS（pH值7.4）洗滌。以30 g/L BSA室溫封閉30 min，加按比例配好的一抗4 ℃孵育過夜;洗滌后加入與一抗相應(yīng)種屬的二抗室溫孵育50 min;DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。放入乙醇及二甲苯中脫水晾干，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，進(jìn)行圖像采集分析。以細(xì)胞核深棕色為強陽性，棕黃色為中度陽性，淺黃色為弱陽性，藍(lán)色為陰性。對每個組織點識別分析出強陽性、中度陽性、弱陽性及陰性的細(xì)胞數(shù)量、百分比，進(jìn)行H-score評分。H-score=∑（PI×I），其中PI為陽性細(xì)胞數(shù)占切片中所有細(xì)胞數(shù)的百分比，I為著色強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graph Pad Prism 5軟件自帶的統(tǒng)計學(xué)分析模塊進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以[AKx-D]±s的形式表示，兩組之間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶mRNA在BEAS-2b以及A549細(xì)胞中的表達(dá)比較

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2b相比較，肺腺癌細(xì)胞A549中METTL3 mRNA的表達(dá)水平顯著上升（t=5.708，P<0.05），METTL14和WTAP mRNA的表達(dá)水平顯著下降（t=24.080、9.207，P<0.05）。見表2。

2.2 RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶蛋白在BEAS-2b及A549細(xì)胞中的表達(dá)比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2b相比，肺腺癌細(xì)胞A549中METTL3、METTL14蛋白的表達(dá)水平均顯著上升（t=6.502、6.869，P<0.05），而WTAP蛋白的表達(dá)水平則顯著下降（t=8.822，P<0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1、表3。

2.3 RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶在人肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá)比較

IHC檢測顯示，METTL3、METTL14定位于細(xì)胞核內(nèi)，肺腺癌組織中二者的表達(dá)水平較癌旁組織顯著升高（t=3.055、4.339，P<0.05）;WTAP定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，肺腺癌組織中其表達(dá)水平較癌旁組織下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.611，P<0.05）。見圖2、表4。

3 討論

已有研究結(jié)果表明，RNA的m6A修飾在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，包括干細(xì)胞的自我更新和分化、組織發(fā)育、熱休克反應(yīng)、晝夜節(jié)律控制、DNA損傷修復(fù)等[15-17]。除此之外，m6A修飾還可以影響mRNA的穩(wěn)定性、剪接、轉(zhuǎn)運、定位、翻譯以及微小RNA（miRNA）加工和RNA與蛋白質(zhì)間的相互作用[18-22]。RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶作為重要的m6A修飾蛋白在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。已有研究證實，RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶可以作為“促癌基因”發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用，例如，METTL3在胃癌表達(dá)明顯升高，可促進(jìn)mym型鋅指蛋白1（ZMYM1）mRNA的m6A修飾，增強其穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)ZMYM1相關(guān)復(fù)合物對E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[10];WTAP在急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮著類似“原癌基因”的作用[23];WTAP在膀胱癌組織表達(dá)明顯上升，有望成為潛在的治療靶點[24]。此外，還有研究認(rèn)為，RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶在部分癌癥中發(fā)揮“抑癌基因”的作用，例如，上調(diào)METTL3能明顯抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等，并誘導(dǎo)G0/G1期阻滯，這可能是通過PI3K-Akt-mTOR通路來實現(xiàn)的[25];而METTL14在肝癌中通過與DGCR8相互作用，能上調(diào)microRNA-126的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[13]。

RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶在肺腺癌中的作用尚不明確，因此本研究比較了人肺腺癌細(xì)胞和正常人肺上皮細(xì)胞、人肺腺癌組織和癌旁組織中RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與正常人肺上皮細(xì)胞及癌旁組織相比，人肺腺癌細(xì)胞及肺腺癌組織中METTL3的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著上升;METTL14蛋白水平在肺腺癌組織中的表達(dá)同樣顯著升高，但mRNA表達(dá)水平下降。METTL14蛋白和mRNA表達(dá)不一致，分析原因可能為：mRNA雖表達(dá)下降，但因某種原因穩(wěn)定性增加，導(dǎo)致降解減少，進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白表達(dá)增加;或者是METTL14蛋白降解減少，蛋白表達(dá)量增加對mRNA的表達(dá)產(chǎn)生阻遏，使mRNA表達(dá)減少。其具體機(jī)制尚不清楚，這是我們下一步探討的重點問題之一。但作為酶類，METTL14發(fā)揮生物學(xué)作用主要在蛋白水平，因此我們認(rèn)為蛋白水平的結(jié)果更有意義。另外，作為METTL3-METTL14復(fù)合體的重要的協(xié)同蛋白，不論在mRNA水平還是在蛋白水平，WTAP的表達(dá)均明顯下降。WTAP表達(dá)下降的可能原因之一是，在肺腺癌中，其RNA m6A修飾并不主要是METTL3-METTL14復(fù)合體介導(dǎo)的，METTL3和METTL14可能單獨作用介導(dǎo)RNA m6A的催化作用;另一原因可能為，在肺腺癌組織中存在另外一種METTL3-METTL14復(fù)合體的協(xié)同蛋白，該蛋白與WTAP相互競爭，共同協(xié)助復(fù)合體的催化作用，具體蛋白類別還需進(jìn)一步研究。

從本文研究結(jié)果結(jié)合RNA m6A的廣泛生物學(xué)功能來看，一定存在某些依賴于m6A修飾的機(jī)制影響著肺腺癌的生物學(xué)過程。需要進(jìn)一步結(jié)合m6A高通量測序等一系列手段挖掘潛在的結(jié)合靶點，這也是我們下一步將要進(jìn)行的研究工作。

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（本文編輯 馬偉平）

[收稿日期]2019-09-04; [修訂日期]2020-03-19

[基金項目]國家自然科學(xué)基金面上項目（81670822）;青島市醫(yī)療衛(wèi)生B類重點學(xué)科（青衛(wèi)科教字〔2019〕9號）

[第一作者]趙琦（1994-），女，碩士研究生。

[通信作者]牟曉峰（1970-），男，碩士，主任技師，碩士生導(dǎo)師。E-mail：muxiaofeng2005@126.com。