Six1對(duì)支氣管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及纖維化的影響

王文鑫　楊召川　曲政海　王沖　徐雷　張夢(mèng)雪

[摘要]目的 探討Six1對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE）間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及纖維化的影響。方法 體外培養(yǎng)16HBE細(xì)胞株并分成3組，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染Six1（NM_005982）-GV146質(zhì)粒，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染GV146對(duì)照質(zhì)粒，空白對(duì)照組僅給予LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染48 h后用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化;采用RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測Six1、E-鈣黏蛋白、α肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、纖維粘連蛋白、角蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果 與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞間隙增大、形態(tài)發(fā)生梭形改變;Six1、α肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、纖維粘連蛋白的mRNA及蛋白表達(dá)增高，差異有顯著性（F=11.40～881.42，P<0.05）;E-鈣黏蛋白、角蛋白mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低，差異有顯著性（F=10.71～20.37，P<0.05）。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組以上各mRNA及蛋白的表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 Six1過表達(dá)可使16HBE細(xì)胞發(fā)生EMT和纖維化改變。

[關(guān)鍵詞] Six1;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化;支氣管;上皮細(xì)胞;氣道重塑;哮喘

[中圖分類號(hào)] R562.26[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A[文章編號(hào)] 2096-5532（2020）04-0399-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.083[HT]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.1000.017.html;2020-04-18 09：38

EFFECT OF SIX1 ON EPITHELIAL-MESENCHYMAL TRANSITION AND FIBROSIS IN HUMAN BRONCHIAL EPITHELIAL CELL LINE 16HBE

WANG Wenxin， YANG Zhaochuan， QU Zhenghai， WANG Chong， XU Lei， ZHANG Mengxue

（Depart-ment of Pediatrics， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of Six1 on epithelial-mesenchymal transition （EMT） and fibrosis in human bronchial epithelial cells （16HBE）.

Methods 16HBE cells were cultured in vitro and then they were divided into experimental group transfected with Six1 （NM_005982）-GV146 plasmid， negative control group transfected with GV146 control plasmid， and blank control group treated with the LipofectamineTM 2000 transfection reagent. At 48 hours after transfection， an inverted microscope was used to observe the morphological changes of cells， and RT-PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of Six1， E-cadherin， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin， fibronectin， and keratin.ResultsCompared with the negative control group and the blank group， the experimental group showed a significant increase in intercellular space and had a spindle shape， as well as significant increases in the mRNA and protein expression of Six1， α-SMA， vimentin， and fibronectin （F=11.40-881.42，P<0.05） and significant reductions in the mRNA and protein expression of E-cadherin and keratin （F=10.71-20.37，P<0.05）. There were no significant differences in mRNA and protein expression between the negative control group and the blank control group （P>0.05）.Conclusion Six1 overexpression may induce EMT and fibrosis of 16HBE cells.

[KEY WORDS] Six1; epithelial-mesenchymal transition; bronchi; epithelial cells; airway remodeling; asthma

支氣管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是氣道重塑中最重要的改變之一，而氣道重塑是支氣管哮喘過程中最為特征性的病理變化之一。目前，針對(duì)支氣管哮喘的治療仍然是以吸入糖皮質(zhì)激素為主的對(duì)癥治療，雖然改善了大部分哮喘病人的臨床癥狀，但不能完全阻止氣道重塑的發(fā)生和發(fā)展[1]。因此，探討支氣管哮喘病人氣道重塑的機(jī)制、探尋針對(duì)EMT發(fā)生和發(fā)展的治療方法，對(duì)有效治療支氣管哮喘具有重要意義。Six1是同源盒基因家族的成員，可特異性地調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在正常成年人組織中不表達(dá)或者表達(dá)量很低[2]，在多種疾病中表達(dá)量增高，包括肺癌和肺纖維化[3-5]，但Six1對(duì)支氣管哮喘及EMT的作用機(jī)制尚不清晰。本實(shí)驗(yàn)探討Six1對(duì)支氣管上皮細(xì)胞及氣道重塑的影響，為今后更有效地防治哮喘氣道重塑提供新的分子靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及來源

人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫）;Six1（NM_005982）-GV146過表達(dá)質(zhì)粒甘油菌（吉?jiǎng)P公司）;質(zhì)粒抽提試劑盒（TIANGEN公司）;GAPDH、Six1、E-鈣黏蛋白、波形蛋白、α-肌動(dòng)蛋白、纖維粘連蛋白、角蛋白引物（北京睿博興科生物技術(shù)有限公司）;角蛋白、E-鈣黏蛋白、纖維粘連蛋白、α-肌動(dòng)蛋白、GAPDH一抗（CST公司），Six1抗體（Affinity公司），波形蛋白一抗（Elabscience公司）;抗兔二抗、抗鼠二抗（Elabscience公司）;胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶EDTA消化液、二甲基亞砜（美國Sigma公司）;TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ（RR820A）以及RNAiso Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （RR047A）（Takara公司）。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 質(zhì)粒擴(kuò)增及抽提 將攜帶綠色熒光蛋白的Six1（NM_005982）-GV146過表達(dá)質(zhì)粒及GV146對(duì)照質(zhì)粒甘油菌以1∶300接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基溶液中，置于培養(yǎng)箱中以37 ℃、250 r/min振蕩過夜培養(yǎng)12 h。按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒的抽提。對(duì)抽提后的質(zhì)粒測定純度并保存于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.2 分組及轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d取生長至對(duì)數(shù)期的16HBE細(xì)胞，接種于12孔板，待細(xì)胞融合至90%時(shí)，將細(xì)胞分為以下3組。①實(shí)驗(yàn)組（A組）：轉(zhuǎn)染重組的Six1-GV146質(zhì)粒;②陰性對(duì)照組（B組）：轉(zhuǎn)染GV146對(duì)照質(zhì)粒;③空白對(duì)照組（C組）：僅給予LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染效率。選取轉(zhuǎn)染效率達(dá)50%以上的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR檢測 將3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA，并測定RNA濃度和純度。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的cDNA，并用RT-PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)的Six1及E-鈣黏蛋白、纖維粘連蛋白、波形蛋白、α-肌動(dòng)蛋白、角蛋白的mRNA表達(dá)水平，其內(nèi)參為GAPDH，擴(kuò)增引物及其序列見表1。使用TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。記錄各組樣本擴(kuò)增CT值，采用2-ΔΔCT的方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測 將各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解（RIPA∶PMSF=100∶1），離心后取上清。使用BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，50 g/L奶粉封閉1 h，將封閉后的PVDF膜分別置于相應(yīng)的一抗孵育液中，4 ℃搖床孵育過夜。加入二抗，室溫孵育60 min后，滴加ECL顯影劑于顯影儀中曝光顯影。用Image J軟件計(jì)算各組蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為對(duì)照分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 16HBE細(xì)胞中Six1轉(zhuǎn)染情況

轉(zhuǎn)染24 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察到帶有綠色熒光蛋白的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)至細(xì)胞中。見圖1。轉(zhuǎn)染48 h后，RT-PCR及Western blot檢測顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組16HBE細(xì)胞中Six1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯增高，差異有顯著意義（F=881.42、78.38，P<0.01），而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.53、0.05，P>0.05）。結(jié)果表明，Six1轉(zhuǎn)染至16HBE細(xì)胞并表達(dá)。見表2和圖2。

2.2 Six1對(duì)16HBE細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡觀察顯示，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組16HBE細(xì)胞為鵝卵石樣單層細(xì)胞，細(xì)胞間連接緊密，且兩組間細(xì)胞形態(tài)無明顯差異;與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞拉長呈梭形改變，細(xì)胞間連接不緊密，細(xì)胞間隙增大。提示上調(diào)Six1的表達(dá)可使16HBE上皮細(xì)胞出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改變。見圖3。

2.3 Six1對(duì)16HBE細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組E-鈣黏蛋白、角蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，差異有顯著性（F=10.71～20.37，P<0.05）;而α肌動(dòng)蛋白、波形蛋白的mRNA及蛋白表達(dá)明顯增高，差異有顯著性（F=11.40～73.97，P<0.05）。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的E-鈣黏蛋白、角蛋白、α肌動(dòng)蛋白、波形蛋白的mRNA及蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.01～0.89，P>0.05）。見表3和圖4。

2.4 Six1對(duì)16HBE細(xì)胞中纖維粘連蛋白mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組纖維粘連蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，差異有顯著性（F=230.00、23.26，P<0.01），陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組的mRNA及蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.38、1.15，P>0.05）。見表4和圖5。

3 討論

氣道重塑是發(fā)生在支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺纖維化等疾病中最重要的病理改變之一，也是導(dǎo)致哮喘病人對(duì)常規(guī)治療藥物反應(yīng)性降低的主要原因之一[6]。在支氣管哮喘反復(fù)發(fā)作的過程中，呼吸道上皮細(xì)胞反復(fù)發(fā)生損傷和修復(fù)，導(dǎo)致氣道壁結(jié)構(gòu)和功能持續(xù)改變，造成氣道重塑[7-9]。支氣管上皮細(xì)胞是呼吸系統(tǒng)最主要的防御屏障，除了與物理屏障、局部免疫的發(fā)生發(fā)展有關(guān)外，在某些慢性氣道疾病的病程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，包括支氣管哮喘的氣道重塑過程[10]。相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)OVA致敏的哮喘小鼠支氣管肺組織出現(xiàn)明顯增厚和廣泛的纖維化，且在支氣管肺泡灌洗液及支氣管肺組織中均發(fā)現(xiàn)Six1表達(dá)的增高，進(jìn)一步抑制Six1表達(dá)后小鼠氣道炎癥和纖維化得到緩解[11]，初步證實(shí)Six1參與支氣管哮喘纖維化過程，但其對(duì)氣道重塑和纖維化作用機(jī)制尚不清楚。

Six1是近年發(fā)現(xiàn)的同源盒基因中的一種類型，定位于人染色體14q23上，涉及多種組織器官發(fā)育，在成年后的多種組織中無表達(dá)或表達(dá)量低于檢測限度，卻在多種疾病中過度表達(dá)[12-13]。已有大量的研究證實(shí)，Six1可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，且伴隨著EMT的現(xiàn)象[14-16]。近年來關(guān)于Six1與呼吸道疾病的相關(guān)性研究也逐漸得到更多人的關(guān)注，結(jié)果顯示Six1的異常表達(dá)與肺癌的增殖和遷移密切相關(guān)，在肺癌組織中Six1促進(jìn)了癌周及癌內(nèi)的淋巴管形成、淋巴入侵以及肺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[17]。我們前期研究結(jié)果顯示，Six1在哮喘模型小鼠中高表達(dá)[11]，推測Six1可能在哮喘氣道重塑中參與了EMT和纖維化的過程，干預(yù)Six1的表達(dá)可能會(huì)影響EMT及氣道重塑。

EMT是近年來人們提出的關(guān)于纖維化機(jī)制的新思路。在EMT過程中上皮細(xì)胞通過轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，使細(xì)胞具有了更強(qiáng)的侵襲性、運(yùn)動(dòng)性和抵抗性。上皮細(xì)胞形態(tài)從鵝卵石樣單層細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榭蛇\(yùn)動(dòng)紡錘狀細(xì)胞，細(xì)胞間及細(xì)胞基質(zhì)間連接的緊密程度下降，伴有上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物如ZO-1、E-鈣黏蛋白等表達(dá)下調(diào)，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如α-肌動(dòng)蛋白、波形蛋白等表達(dá)增加，基膜發(fā)生降解，細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力，從而發(fā)生了分子重塑和表型的改變[18-20]。相關(guān)研究分別從肺纖維化病人及哮喘小鼠也檢測到肺上皮細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，初步證實(shí)了哮喘的過程中存在EMT現(xiàn)象[21]。越來越多的研究表明，上皮細(xì)胞EMT在纖維化中扮演重要的角色[22]，纖維粘連蛋白是成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，氣道成纖維細(xì)胞在氣道纖維化和氣道重塑的過程具有重要作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘發(fā)生的早期就已經(jīng)開始?xì)獾乐厮艿倪^程，并伴隨著上皮細(xì)胞表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的特征[24]，表明支氣管EMT可能是哮喘氣道重塑發(fā)生早期的一種病理改變。本文研究探討Six1與EMT、纖維化和氣道重塑的關(guān)系。結(jié)果顯示，正常16HBE細(xì)胞中僅有少量的Six1表達(dá)，而上調(diào)Six1表達(dá)后16HBE細(xì)胞則發(fā)生了形態(tài)的改變，由鵝卵石樣向梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞間隙增加，出現(xiàn)了間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。進(jìn)一步進(jìn)行mRNA和蛋白檢測表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)

志物E-鈣黏蛋白、角蛋白顯著降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-肌動(dòng)蛋白、波形蛋白的表達(dá)均有不同程度的增加，并且在此過程中成纖維細(xì)胞標(biāo)志物纖維粘連蛋白的表達(dá)也明顯升高，說明上調(diào)Six1表達(dá)可使16HBE細(xì)胞發(fā)生EMT，同時(shí)發(fā)生纖維化的改變。

綜上所述，Six1可能是造成呼吸道上皮細(xì)胞EMT、氣道壁纖維化并發(fā)生氣道重塑的原因之一，抑制Six1的表達(dá)對(duì)正常的支氣管上皮不會(huì)產(chǎn)生影響，但對(duì)抑制氣道重塑有一定的作用。本文結(jié)果為未來哮喘的控制和靶向治療提供了新的方向。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）

[收稿日期]2019-11-13; [修訂日期]2020-03-13

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81700029）;山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2017MH017）;青島市民生科技計(jì)劃項(xiàng)目（19-6-32-nsh）

[第一作者]王文鑫（1992-），女，碩士研究生。

[通信作者]曲政海（1963-），男，碩士，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：quzhenghai@163.com。