奶牛乳房炎病畜生鮮乳中大腸桿菌污染狀況及耐藥性分析

鄔元娟　張樹秋　王文博　李鴛鴦

摘要：為了解奶牛乳房炎病畜生鮮乳中大腸桿菌污染狀況及耐藥性，于2019年從濰坊、青島采集牛乳房炎病畜生鮮乳樣品共計(jì)98份，對(duì)其中常見大腸桿菌的污染狀況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，98份奶牛乳房炎病畜生鮮乳樣品中，42份檢出大腸桿菌，檢出率為42.9%。對(duì)檢出的大腸桿菌菌株進(jìn)行10種抗生素的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，檢出的大腸桿菌對(duì)氨芐西林、多西環(huán)素、四環(huán)素有較高的耐藥性，且多數(shù)為多重耐藥菌株。綜上，牛乳房炎病畜生鮮乳中大腸桿菌污染較為嚴(yán)重，建議相關(guān)部門進(jìn)一步加強(qiáng)牛乳房炎病畜生鮮乳的監(jiān)管，采取針對(duì)性風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)措施。

關(guān)鍵詞：奶牛乳房炎病畜;生鮮乳;大腸桿菌;污染狀況;耐藥性

中圖分類號(hào)：S858.23：TS207.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2020）03-0121-04

AbstractIn the study， ninety-eight raw milk samples produced by dairy cattle with mastitis were collected from Weifang City and Qingdao City of Shandong Province in 2019. The contamination situation of Escherichia coli in raw milk samples and its antibiotic resistance were analyzed. The results showed that Escherichia coli was found in 42 samples with the detection rate as 42.9%. The results of the susceptibility tests of Escherichia coli strains to 10 types of antibiotics showed that the strains had higher antibiotic resistance to ampicillin， doxycycline and tetracycline， and most of them were multi-drug resistance strains. In conclusion， the contamination situation of Escherichia coli in raw milk produced by dairy cattle with mastitis in the researched areas were quite serious， so the relevant governmental departments should strengthen the supervision to fresh milk and implement the targeted risk monitoring measures.

KeywordsDairy Cattle with Mastitis; Raw milk; Escherichia coli; Contamination situation; Antibiotic resistance

乳房炎是奶牛的一種常見多發(fā)性疾病，是影響世界奶牛業(yè)發(fā)展的主要疾病之一，不僅嚴(yán)重影響奶牛的健康及生產(chǎn)能力，而且降低生鮮乳品質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致奶牛乳區(qū)化膿壞死，喪失泌乳能力[1，2]，直接影響著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。世界奶牛協(xié)會(huì)調(diào)查數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)稱全世界約有1/3的奶?；加懈鞣N類型乳房炎，大腸桿菌是引起奶牛乳房炎的重要病源微生物[3-7]。目前奶牛乳房炎防治的主要措施是抗生素治療，但由于長(zhǎng)期盲目地使用抗生素，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，治療效果也愈來愈不理想。

本試驗(yàn)于2019 年對(duì)采自山東濰坊、青島奶牛乳房炎病畜的生鮮乳樣品進(jìn)行大腸桿菌檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)出的大腸桿菌菌株進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn)，以期為選擇有效的抗菌藥以防止抗生素濫用及研究食源性致病菌提供可靠依據(jù)，并為開展奶牛乳房炎病畜生鮮乳產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)、完善奶牛乳房炎病畜生鮮乳致病菌防治體系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣品采集

在濰坊、青島的奶場(chǎng)抽取患乳房炎奶牛的牛乳樣品，共計(jì)98份。每份生鮮乳樣品采集量為200 mL，無菌瓶封裝后冷藏條件下4 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。采樣過程中遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染。

1.2主要試劑及設(shè)備

所用大腸桿菌增菌液、分離培養(yǎng)基及顯色培養(yǎng)基均購(gòu)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司，所有試劑及生化檢定卡均在有效期內(nèi)使用。生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，質(zhì)控菌株均由廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心提供，大腸桿菌質(zhì)控菌株編號(hào)ATCC25922。

1.3檢測(cè)方法

參照《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗(yàn)》 （GB 4789.36—2016）[8]對(duì)樣品中的大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過程嚴(yán)格按照《國(guó)家食源性致病菌監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》中質(zhì)量控制操作程序進(jìn)行，并以標(biāo)準(zhǔn)菌株為對(duì)照菌株進(jìn)行質(zhì)控。

1.4藥敏試驗(yàn)方法

將分離并保存于-80℃冰箱的大腸桿菌菌株取出復(fù)蘇，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上，挑取菌落數(shù)個(gè)置于接種水（DEMINERALIZED WATER）中，用0.5麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?取上述菌液60 μL，加入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，混勻;吸取稀釋菌液，加入藥敏板中，毎孔100 μL;將板條放入恒溫培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)16～24 h后取出，判讀各個(gè)孔的陰陽(yáng)性結(jié)果。

1.5大腸桿菌藥敏板及其濃度

氨芐西林（AM） 0.25～128 μg/mL，阿莫西林-克拉維酸（AMC） 0.25/0.12～128/64 μg/mL，慶大霉素（GEN）0.25～128 μg/mL，復(fù)方新諾明（T/S） 0.12/2.4～64/1 208 μg/mL，環(huán)丙沙星（CFX） 0.25～128 μg/mL，磺胺異惡唑（G）2～1 024 μg/mL，多西環(huán)素（DOX）0.25～128 μg/mL，卡那霉素（KAN） 0.5～256 μg/mL，美羅培南（EMP） 0.25～128 μg/mL，四環(huán)素（TET） 0.25～128 μg/mL，上海星佰生物技術(shù)有限公司。

2結(jié)果與分析

2.1奶牛乳房炎病畜生鮮乳產(chǎn)品中大腸桿菌檢出總體情況

2019年采自濰坊、青島的98份奶牛乳房炎病畜生鮮乳樣品中，有42份檢出大腸桿菌，大腸桿菌檢出率為42.9% （42/98）。

2.2大腸桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果分析與MIC值

按照CLSI M100S 26th Edtion 抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)分離到的42株大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2.2.1大腸桿菌菌株的多重耐藥性情況42株大腸桿菌中有27株為耐藥菌株，耐藥菌株率為64.3%。27株耐藥大腸桿菌中，6株菌耐一種抗生素，2株菌耐二種抗生素，1株菌耐三種抗生素，2株菌耐四種抗生素，2株菌耐五種抗生素，5株菌耐六種抗生素，5株菌耐七種抗生素，3株菌耐八種抗生素，1株菌耐九種抗生素（圖1）。

2.2.2大腸桿菌耐藥菌株對(duì)十種抗生素的耐藥率由圖2可見，分離到的27株大腸桿菌耐藥菌株對(duì)氨芐西林（AM）、多西環(huán)素（DOX）、四環(huán)素（TET）的耐藥率較高，達(dá)到47.6%;其次為磺胺異惡唑（G）、復(fù)方新諾明（T/S），分別為45.2%、40.5%;對(duì)環(huán)丙沙星（CFX）和慶大霉素（GEN）的耐藥率也較高，分別為30.9%和21.4%。但對(duì)阿莫西林-克拉維酸（AMC）和美羅培南（EMP）的耐藥率較低，分別為7.1%和2.4%。

2.2.3大腸桿菌對(duì)十種抗生素的耐藥譜27株大腸桿菌耐藥菌株對(duì)十種抗生素的耐藥譜見表1。

3討論與結(jié)論

乳制品已經(jīng)成為我國(guó)居民生活中不可或缺的食品，其食用安全得到國(guó)家及民眾的極大關(guān)注。近年來乳源性致病菌的危害已經(jīng)引起了相關(guān)政府部門和相關(guān)研究者的極大重視[9，10]。大腸桿菌是一種人畜共患病菌，可引起食物中毒。王曉等[2]對(duì)中國(guó)北方地區(qū)某奶牛場(chǎng)牛奶樣品中大腸桿菌的耐藥情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所分離的28株大腸桿菌對(duì)苯唑西林和萬古霉素的耐藥率為100%，對(duì)35種抗生素共呈現(xiàn)16種多重耐藥譜[7]。石潤(rùn)佳等[4]對(duì)華北地區(qū)乳房炎牛奶樣中大腸桿菌耐藥情況的分析表明，所分離的17株大腸桿菌菌株對(duì)青霉素、苯唑西林、林可霉素3種藥物的耐藥率高達(dá)100%，表現(xiàn)出高度耐藥和多重耐藥。許丹丹等收集新疆石河子地區(qū)乳房炎牛奶樣并分析其大腸桿菌耐藥情況，發(fā)現(xiàn)所分離的16 株大腸桿菌對(duì)阿莫西林、四環(huán)素均耐藥。隨著抗生素在畜牧業(yè)中的大量使用，大腸桿菌的耐藥水平越來越高，耐藥譜越來越廣，多重耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。

本研究檢測(cè)了2019年從濰坊、青島采集的奶牛乳房炎病畜生鮮乳樣品的大腸桿菌污染情況，并對(duì)檢出的大腸桿菌菌株進(jìn)行了10種抗生素藥敏試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在98批次奶牛乳房炎病畜生鮮乳樣品中，有42份檢出了大腸桿菌;分離到的42株菌中有15株敏感菌株，27株耐藥菌株，耐藥菌株率為64.3%;這27株耐藥菌對(duì)氨芐西林、多西環(huán)素、四環(huán)素耐藥率最高，均為47.6%，而對(duì)阿莫西林-克拉維酸（AMC）和美羅培南（EMP）的敏感性較高。27株耐藥菌均對(duì)一種、兩種或多種抗生素耐藥，其中19株為耐三種或三種以上抗生素的多重耐藥菌株，耐6種抗生素的耐藥組合氨芐西林（AM）+多西環(huán)素（DOX）+四環(huán)素（TET）+磺胺異惡唑（G）+復(fù)方新諾明（T/S）+環(huán)丙沙星（CFX）出現(xiàn)4次，耐7種抗生素的耐藥組合氨芐西林（AM）+多西環(huán)素（DOX）+四環(huán)素（TET）+磺胺異惡唑（G）+復(fù)方新諾明（T/S）+卡那霉素（KAN）+慶大霉素（GEN）出現(xiàn)3次。因此，可以根據(jù)本研究結(jié)果選擇有效抗大腸桿菌的藥物，可以減少氨芐西林、多西環(huán)素、四環(huán)素的用藥，而用阿莫西林-克拉維酸或美羅培南。

綜合來看，本次奶牛乳房炎病畜生鮮乳樣品的檢出率較高，致病菌的多重耐藥性也較高，希望有關(guān)部門加強(qiáng)監(jiān)管，減少由此可能引發(fā)的食源性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)檢測(cè)出的大腸桿菌菌株對(duì)阿莫西林-克拉維酸和美羅培南的敏感性較高，耐藥譜圖也表現(xiàn)出了一些規(guī)律性，在多重耐藥譜圖中也出現(xiàn)了相似性，這為以后有效選擇抗菌藥、防止抗生素濫用及研究食源性致病菌提供了可靠依據(jù)，為完善乳制品致病菌防治體系奠定了基礎(chǔ)。

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