外源糖類和維生素對(duì)萊氏綠僵菌Metarhizium rileyi孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用

劉守柱　劉雙雙　姜武玲　王馨玫　王文杰

摘要：萊氏綠僵菌Metarhizium rileyi是重要的昆蟲病原真菌，對(duì)鱗翅目害蟲有很好的防治效果，但存在殺蟲速度慢的缺點(diǎn)。為了提高萊氏綠僵菌孢子的萌發(fā)速度，縮短對(duì)寄主的致死時(shí)間，在孢子懸液中分別添加不同糖類和維生素類，以測(cè)定外源營(yíng)養(yǎng)對(duì)萊氏綠僵菌孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用。配制含有不同濃度糖和維生素的SMY液體培養(yǎng)基后，接種M.rileyi孢子，25℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔24 h，用血球計(jì)數(shù)板鏡檢孢子萌發(fā)率。結(jié)果表明：接種24 h后，以10 g/L甘露糖、5 g/L維生素B6和5 g/L維生素C對(duì)孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用較好，孢子萌發(fā)率分別為3.50%、3.67%和0.83%;隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，10 g/L甘露糖、5 g/L維生素C依然對(duì)孢子萌發(fā)有較好的促進(jìn)作用，5 g/L維生素B6對(duì)孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用逐漸降低;進(jìn)一步測(cè)定甘露糖和維生素C對(duì)孢子萌發(fā)的濃度效應(yīng)，甘露糖濃度為25.0 g/L時(shí)對(duì)孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用最好，維生素C濃度為0.2 g/L時(shí)最好。以上結(jié)果表明，對(duì)M. rileyi孢子萌發(fā)促進(jìn)效果最好的外源營(yíng)養(yǎng)是甘露糖和維生素C，最適濃度分別是25.0 g/L和0.2 g/L。

關(guān)鍵詞：萊氏綠僵菌;孢子萌發(fā);糖;維生素

中圖分類號(hào)：S476.12文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2020）03-0097-05

AbstractMetarhizium rileyi is an important entomopathogenic fungus with good control effect against Lepidopteran pests， while its insecticidal speed was slow. Hence， the promotion effects of external saccharides and vitamins on spore germination of Metarhizium rileyi were analyzed to find a way to shorten the lethal time and improve the spore germination speed of M. rileyi on host. The conidia of M. rileyi were inoculated into 6 saccharide and 4 vitamin fluid media， and cultured in the conditions of 25℃ and 180 r/min on the incubator shaker;the germinated spores were counted by hemocytometer under microscopy every 24 h after inoculation. The results showed that 10 g/L mannose， 5 g/L vitamin B6 and 5 g/L vitamin C had better promotion effects on spore germination after 24 h， and the spore germination rates were 3.5%， 3.67% and 0.83% respectively. With the extension of culture time， 10 g/L mannose and 5 g/L vitamin C still had better promoting effects on spore germination， while the promoting effect of 5 g/L vitamin B6 gradually decreased. Further study showed that mannose had the best promotion effect when the concentration was 25.0 g/L， while the optimum concentration of vitamin C was 0.2 g/L. It was concluded that mannose and vitamin C were the best external nutrients in promoting spore germination of M. rileyi at the concentrations of 25.0 g/L and 0.2 g/L，respectively.

KeywordsMetarhizium rileyi; Spore germation; Saccharide; Vitamin

萊氏綠僵菌（Metarhizium rileyi）隸屬于子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocreales）麥角菌科（Clavicipitacea）綠僵菌屬（Metarhizium），舊稱萊氏野村菌Nourmeae rileyi[1]，是一種在自然界廣泛分布的昆蟲病原真菌，對(duì)多種鱗翅目害蟲，尤其是夜蛾科害蟲，如甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）[2，3]、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）[4]、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）[5，6]、新入侵我國(guó)的草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）[7]等，共計(jì)60多種害蟲[8]均有明顯的致病作用，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的生防真菌。昆蟲被M. rileyi侵染死亡后，蟲體僵硬，菌絲由內(nèi)向外穿透體表，在僵尸表面大量產(chǎn)孢，形成綠色霉層。成熟孢子在田間可借助氣流、水流進(jìn)行擴(kuò)散傳播，黏附到其他蟲體表面后，孢子萌發(fā)形成再侵染，導(dǎo)致昆蟲疾病在一定的區(qū)域內(nèi)自然流行，因而可以長(zhǎng)久控制害蟲的種群數(shù)量，這種疾病流行能力可以在田間人工誘導(dǎo)發(fā)生[9]。

M. rileyi的侵染過程起始于孢子在昆蟲體壁表面的萌發(fā)。孢子萌發(fā)后產(chǎn)生芽管，然后芽管分泌幾丁質(zhì)酶[10]等降解昆蟲表皮，穿透體壁后進(jìn)入血腔，完成侵染過程。由此可見，M. rileyi孢子的萌發(fā)能力與侵染成功的幾率有直接的聯(lián)系，萌發(fā)速度快，萌發(fā)率高，相應(yīng)會(huì)提高病原菌的侵染成功率和致死效果。在自然條件下，孢子黏附到昆蟲體表后，由于昆蟲上表皮堅(jiān)硬、疏水性強(qiáng)、缺少游離的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[11]，因而孢子處于外源營(yíng)養(yǎng)極度貧乏的狀態(tài)，僅能依靠自身儲(chǔ)備營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行萌發(fā)。如果在此過程中，添加適量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如油類和糖類，能協(xié)助或促進(jìn)孢子萌發(fā)的幾率[12]，延長(zhǎng)芽管生存時(shí)間，必將會(huì)提高病菌的侵染、致死效果。

為了提高M(jìn).rileyi分生孢子在營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)下的萌發(fā)幾率，增強(qiáng)對(duì)害蟲的寄生作用，本研究以較為常見且水溶性較好的糖類和維生素類作為外源營(yíng)養(yǎng)，在離體條件下測(cè)定兩類物質(zhì)對(duì)孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用，以期為提高M(jìn). rileyi 的田間應(yīng)用效果提供有益借鑒。

1材料與方法

1.1供試菌株

M. rileyi Nr5772菌株，聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲研究室提供。菌種用薩氏麥芽糖瓊脂酵母（SMAY）固體培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)4～5代后接種至斜紋夜蛾幼蟲體內(nèi)進(jìn)行復(fù)壯，再次純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2供試糖及維生素

選擇葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、阿拉伯糖、甘露糖6種糖類及維生素C、維生素B1、維生素B3、維生素B6 4種維生素類作為外源營(yíng)養(yǎng)，測(cè)定其對(duì)M. rileyi孢子萌發(fā)的影響。

1.3孢子萌發(fā)的測(cè)定

在無菌條件下，用挑針挑取適量孢子粉，轉(zhuǎn)移到含有0.10 g/L吐溫80的無菌水中，充分振蕩混勻后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整孢子濃度為每毫升1×107個(gè)，備用。

1.3.1外源糖類和維生素對(duì)孢子萌發(fā)的影響稱取0.2 g糖類，加入到150 mL三角瓶中，然后加入19 mL無菌水使之充分溶解，再加入1 mL配好的孢子懸浮液，配成糖濃度為10 g/L的孢子懸浮液，25℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，以不加糖的孢子懸浮液作為對(duì)照組。相同方法，分別稱取維生素0.1 g，配制維生素濃度為5 g/L的孢子懸浮液，以測(cè)定不同種類維生素對(duì)孢子萌發(fā)的影響。所有處理均重復(fù)3次。

1.3.2孢子萌發(fā)測(cè)定每隔24 h用光學(xué)顯微鏡觀察、記錄孢子萌發(fā)情況。觀察時(shí)，從各組處理當(dāng)中移出少量培養(yǎng)液，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板觀察孢子的萌發(fā)情況并計(jì)數(shù)，記錄各時(shí)間孢子的萌發(fā)個(gè)數(shù)，并計(jì)算出各時(shí)間的孢子萌發(fā)率。共觀察96 h。

1.3.3外源糖類和維生素對(duì)孢子萌發(fā)的濃度效應(yīng)根據(jù)1.3.2的測(cè)定結(jié)果，選擇對(duì)孢子萌發(fā)促進(jìn)效應(yīng)最好的糖和維生素，分別設(shè)置0.2、1.0、5.0、25.0、100.0 g/L系列濃度，測(cè)定不同濃度下孢子的萌發(fā)率，以確定濃度對(duì)孢子萌發(fā)的影響。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行計(jì)算，采用STDEV.P函數(shù)進(jìn)行誤差估計(jì);多重比較采用DPS 7.05軟件Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1外源糖類對(duì)M.rileyi孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用

振蕩培養(yǎng)24 h，M. rileyi孢子在10 g/L蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、阿拉伯糖溶液中未見萌發(fā)或極少萌發(fā)，表明以上糖類在供試濃度下對(duì)孢子萌發(fā)沒有促進(jìn)作用;而在10 g/L甘露糖溶液中M. rileyi孢子平均萌發(fā)率3.5%，明顯好于其他糖類（表1）。經(jīng)方差分析，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、阿拉伯糖處理組與對(duì)照組差異不顯著，與甘露糖處理差異顯著。

培養(yǎng)48 h，各處理以及對(duì)照組孢子均有不同程度萌發(fā)，但仍以10 g/L甘露糖處理組的萌發(fā)率最高。10 g/L葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、阿拉伯糖處理組孢子萌發(fā)率雖然低于甘露糖處理，但明顯高于對(duì)照組，說明以上糖類也有促進(jìn)孢子萌發(fā)的作用。

培養(yǎng)72～96 h，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蔗糖和葡萄糖處理組的孢子萌發(fā)率快速升高，與甘露糖處理組相近，說明蔗糖和葡萄糖對(duì)孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用在培養(yǎng)的后半段較為顯著。

2.2外源維生素對(duì)M.rileyi孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用

培養(yǎng)24 h，M. rileyi孢子在維生素B6和維生素C溶液中萌發(fā)，而在維生素B1、維生素B3和對(duì)照處理中未見萌發(fā)。其中，維生素B6的促進(jìn)作用好于維生素C（表2）。

培養(yǎng)48 h，各種維生素及對(duì)照溶液中均有孢子萌發(fā)，其中維生素B6處理的萌發(fā)率最高，其次為維生素C處理，兩者間差異不顯著，但顯著高于其他處理。

培養(yǎng)72 h，維生素C處理中的孢子萌發(fā)率最高，達(dá)44.17%，顯著高于維生素B6（12.33%）及其他處理的萌發(fā)率。前期表現(xiàn)較好的維生素B6萌發(fā)率漲幅不大，說明持效性較差。持續(xù)培養(yǎng)至96 h，各處理之間的趨勢(shì)與培養(yǎng)72 h時(shí)基本一致。

綜合表1和表2，10 g/L甘露糖、5 g/L維生素C在培養(yǎng)24～48 h內(nèi)對(duì)孢子萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用，并且有比較好的持效性，因而選擇二者作為孢子萌發(fā)促進(jìn)劑，進(jìn)行下一步的濃度效應(yīng)測(cè)定。雖然5 g/L維生素B6在24～48 h階段內(nèi)也有很好的促進(jìn)作用，但后期增幅不大;與之相反，10 g/L葡萄糖溶液在72～96 h階段內(nèi)有很好的促進(jìn)作用，但在24～48 h內(nèi)促進(jìn)萌發(fā)的作用較低，說明維生素B6和葡萄糖對(duì)孢子萌發(fā)的整體效果較差，因而不能作為良好的孢子萌發(fā)促進(jìn)劑。

2.3甘露糖促進(jìn)M.rileyi孢子萌發(fā)的濃度效應(yīng)

在不同濃度甘露糖溶液中，M. rileyi孢子的萌發(fā)率變化趨勢(shì)相似（圖1），即在0.2～25.0 g/L范圍內(nèi)，孢子萌發(fā)率隨著糖濃度的升高而增高，此后快速下降;最有利于孢子萌發(fā)的甘露糖濃度為25.0 g/L。在相同濃度甘露糖溶液處理下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，萌發(fā)率總體來說呈升高趨勢(shì)。

2.4維生素C促進(jìn)M.rileyi孢子萌發(fā)的濃度效應(yīng)

從圖2中可以看出，M. rileyi孢子在低濃度維生素C溶液中萌發(fā)率較高，在高濃度溶液中萌發(fā)率較低，萌發(fā)率與維生素C濃度呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，最有利于孢子萌發(fā)的濃度為0.2 g/L。在相同濃度維生素C溶液處理中，孢子萌發(fā)率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。

3討論與結(jié)論

眾所周知，生物防治是害蟲綜合治理的重要方法，以其良好的環(huán)境安全性和對(duì)人畜的低毒性而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)尤其是蔬菜生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，從2013—2017年，國(guó)際期刊發(fā)表的生物防治論文以每年20%的速度穩(wěn)步遞增[13]，說明該領(lǐng)域吸引了眾多研究人員參與，具有廣闊發(fā)展前景。雖然生物防治有其獨(dú)具的優(yōu)點(diǎn)，但也有嚴(yán)重的應(yīng)用瓶頸，例如嚴(yán)重依賴環(huán)境條件、效能低、致死速度慢等[14-16]，這在利用昆蟲病原真菌防治害蟲時(shí)尤為突出。

前期研究已經(jīng)表明，導(dǎo)致萊氏綠僵菌殺蟲速度慢的主要障礙是昆蟲的體壁防御，一旦病原菌穿透寄主體壁（cuticle penetration）進(jìn)入血腔，即使病原菌數(shù)量?jī)H為400個(gè)/幼蟲，亦可在3天內(nèi)致寄主死亡[17]。M. rileyi孢子的體壁穿透效率低是其殺蟲速度慢的主要原因，在此過程中，孢子的萌發(fā)率與體壁穿透率有直接關(guān)系，相同條件下孢子萌發(fā)率高必然提高體壁穿透效率，最終縮短致死時(shí)間。因而，提高孢子萌發(fā)率，尤其是研究有利于提高孢子萌發(fā)率的劑型，一直是生防真菌應(yīng)用研究中的重要內(nèi)容[18-20]。

從本研究結(jié)果看，除了研究有利于保存孢子萌發(fā)率的劑型以外，額外添加一些外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為孢子萌發(fā)促進(jìn)劑，也可以明顯提高孢子萌發(fā)率，且以甘露糖和維生素C的效果最佳。進(jìn)一步研究表明：甘露糖的最適質(zhì)量濃度為25.0 g/L，濃度低時(shí)對(duì)M. rileyi孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用較低，而高時(shí)則出現(xiàn)抑制作用;維生素C在低濃度時(shí)對(duì)孢子萌發(fā)促進(jìn)作用明顯，高濃度時(shí)有抑制作用，最適質(zhì)量濃度為0.2 g/L。根據(jù)以上結(jié)果，在制備M. rileyi分生孢子制劑或者在田間應(yīng)用時(shí)，可以人工添加適量的甘露糖或維生素C作為孢子萌發(fā)促進(jìn)劑，以提高生防效果。

需要指出的是，本研究結(jié)果是在室內(nèi)離體條件下測(cè)定的，并不能如實(shí)反映出活體條件下的促進(jìn)作用。許多因素，例如活體昆蟲上表皮及微觀結(jié)構(gòu)是否能吸收或消化額外添加的外源營(yíng)養(yǎng)，孢子-外源營(yíng)養(yǎng)-昆蟲表皮三者之間的互作機(jī)制，均可以影響到外源營(yíng)養(yǎng)對(duì)孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用，因此能不能在活體昆蟲體壁表面也取得相同的效果尚需進(jìn)一步試驗(yàn)確定。

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