嗜熱革節(jié)孢內(nèi)切葡聚糖酶EGⅠ中精氨酸Arg7的功能分析

于偉帥 李多川

摘要：本研究將嗜熱革節(jié)孢GH45家族內(nèi)切葡聚糖酶EGⅠ中的底物結(jié)合位點(diǎn)精氨酸Arg7進(jìn)行飽和突變，測(cè)定其性質(zhì)、動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化，以期分析精氨酸Arg7 的功能。結(jié)果表明，與原酶相比，突變酶R7A的Km有所下降，R7P的kcat顯著性提高，但突變酶的kcat/Km均顯著性降低。原酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，突變酶R7C、R7P和R7V的則為40℃，其余突變酶的均為50℃。原酶于70℃下處理2 h具有61%的活性，相同處理?xiàng)l件下，突變酶R7F、R7H仍具有70%以上的活性，說(shuō)明其熱穩(wěn)定性明顯提高，R7A僅有20%的活性，剩余突變酶均有40%左右的活性。原酶的反應(yīng)最適pH值為5.0，而突變酶R7C的為6.0，剩余突變酶的均為5.0。本試驗(yàn)探究了精氨酸Arg7飽和突變后嗜熱革節(jié)孢GH45家族內(nèi)切葡聚糖酶的性質(zhì)變化，可為GH45家族進(jìn)一步的分子改造和功能研究提供參考。

關(guān)鍵詞：嗜熱革節(jié)孢;內(nèi)切葡聚糖酶;飽和突變;酶學(xué)性質(zhì);熱穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：Q783 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A ?文章編號(hào)：1001-4942（2020）02-0019-08

Abstract Scytalidium thermophilium is a thermophilic fungus whose thermal stability and catalytic activity are the most important properties of industrial enzymes. In this study， the substrate binding site Arg7 in the endoglucanase EGⅠ of GH45 family was saturated mutated， and the changes of properties and kinetic parameters were analyzed. The results showed that only the Km of the mutant enzyme R7A decreased， and the kcat of the mutant enzyme R7P significantly increased， but the kcat/Km of the mutant enzyme significantly decreased compared with the wild enzyme. The optimum reaction temperature of WT was 50℃， while that of R7C， R7P and R7V was 40℃， and that of the residual mutant enzymes was 50℃. The wild enzyme still had 61% activity after treatment at 70℃ for 2 h， and the thermal stability of the mutant enzymes R7F and R7H improved significantly， and more than 70% of the activity was observed after treatment; the activity of the mutant enzyme R7A was only 20% after treated at 70℃ for 2 h， and the other mutant enzymes had about 40% of activity. The optimum pH of WT was 5.0， while the optimum pH of the mutant R7C was 6.0， and the optimum pH of the other mutant enzyme was 5.0. The above results could provide references for further molecular transformation and function study of the GH45 family.

Keywords Scytalidium thermophilium;Endoglucanase; Saturation mutation; Enzymatic properties; Thermal stability

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，是自然界中非常豐富的可再生資源。纖維素酶具有降解纖維素的能力，可將其水解成單糖，在纖維素再利用過(guò)程中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，纖維素的水解需要三種類型的纖維素酶協(xié)同作用：首先是內(nèi)切葡聚糖酶 （endo-β-1，4-glucanases， EC 3.2.1.4）與纖維素隨機(jī)結(jié)合，水解 β-1，4-糖苷鍵生成短鏈纖維素，隨后外切葡聚糖苷酶 （exo-1，4-β-glucanase， EC 3.2.1.91）作用于纖維寡糖末端，切下一個(gè)纖維二糖分子，最后由β-葡萄糖苷酶 （β-1，4-glucosidases， EC 3.2.1.21） 將纖維二糖分子水解為單糖[1，2]。其中，內(nèi)切葡聚糖酶廣泛存在于微生物對(duì)纖維素的水解過(guò)程中[3-5]，被認(rèn)為是纖維素再利用過(guò)程中的重要工業(yè)用酶，是開(kāi)發(fā)最為廣泛的纖維素酶產(chǎn)物。

根據(jù)蛋白質(zhì)序列相似性和催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中 （http：//www.cazy.org） 內(nèi)切葡聚糖酶分屬于15個(gè)糖苷水解酶（GH）家族，包括GH5、GH6、GH7、GH8、GH9、GH10、GH12、GH26、GH44、GH45、GH48、GH51，GH74、GH124和GH148。與大多數(shù)糖苷水解酶家族中的酶不同，GH45家族成員僅為內(nèi)切葡聚糖酶，該酶具有低分子量和高活性[6，7]。此外，Hirvonen等發(fā)現(xiàn)GH45內(nèi)切葡聚糖酶對(duì)無(wú)定形纖維素具有更高的活性，并且在工業(yè)應(yīng)用中具有很大潛力[8]，所以該酶的功能和結(jié)構(gòu)研究對(duì)學(xué)術(shù)和工業(yè)領(lǐng)域都非常重要。GH45家族酶的主要結(jié)構(gòu)特征是由六鏈β-barrel組成的結(jié)構(gòu)域，并且具有跨越蛋白質(zhì)表面的開(kāi)放性底物結(jié)合槽[8]。目前，GH45家族酶的結(jié)構(gòu)可細(xì)分為兩組：組Ⅰ在 β-barrel 和由幾個(gè)長(zhǎng)環(huán)組成的區(qū)域之間形成底物結(jié)合槽，而組Ⅱ中酶的底物結(jié)合槽主要由 β-barrel 形成[8，9]。

嗜熱革節(jié)孢（Scytalidium thermophilium） 是一種嗜熱真菌，其熱穩(wěn)定性和催化活性是工業(yè)用酶的最重要屬性。目前，除了對(duì)嗜熱真菌本身進(jìn)行改造以提高其生產(chǎn)纖維素酶的能力外，酶的工程性改造也一直是研究熱點(diǎn)。本研究擬克隆嗜熱革節(jié)孢GH45家族內(nèi)切葡聚糖酶基因egⅠ，并將底物結(jié)合位點(diǎn)Arg7進(jìn)行飽和突變，測(cè)定酶的性質(zhì)、熱穩(wěn)定性、動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化，以探究Arg7的功能和飽和突變對(duì)EGⅠ的影響，旨在為GH45家族進(jìn)一步的分子改造提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

嗜熱革節(jié)孢 （Scytalidium thermophilium） 菌株，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)分子真菌學(xué)課題組篩選得到;大腸桿菌 （Escherichia coli） 菌株、質(zhì)粒pPIC9K、畢赤酵母GS115，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

Trans2K DNA Marker、限制性核酸內(nèi)切酶和其它工具酶，以及PCR試劑盒、點(diǎn)突變?cè)噭┖芯?gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;RNA提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司;膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司;必克隆新一代試劑盒購(gòu)自南京愛(ài)必夢(mèng)生物材料有限公司;二喹啉甲酸 （bicin-choninic acid， BCA） 蛋白定量試劑盒購(gòu)自杭州弗德生物科技有限公司;LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、BMGY和BMMY培養(yǎng)基等，自備。

1.3 egⅠ基因的克隆

將嗜熱革節(jié)孢接種到纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，50℃培養(yǎng)3 d，刮取菌絲提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)嗜熱革節(jié)孢GH45家族內(nèi)切葡聚糖egⅠ的基因序列 （GenBank： HG313887.1） 設(shè)計(jì)引物，并在上下游引物中分別插入EcoRⅠ 和NotⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線標(biāo)記）。在下游引物加入6個(gè)組氨酸 （His） 標(biāo)簽（波浪線標(biāo)記），上下游引物序列：EGⅠ-F：5′-GCTTACGTAGAATTCGCTGATGGCAAGTCCACCCG-3′;EGⅠ-R：5′-TTAATTCGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGCAGGCACTGATGGTACCA-3′。PCR反應(yīng)體系：cDNA 100 ng，5×TransStart FastPfu Fly Buffer 10 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，TransStart FastPfu Fly DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至50 μL。反應(yīng)程序：94℃ 2 min;94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收片段并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 重組質(zhì)粒和突變質(zhì)粒的構(gòu)建

用EcoRⅠ和NotⅠ 將pPIC9K 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，根據(jù)必克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)將其和egⅠ 目的片段連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K/egⅠ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans -T1，挑單斑進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒定。

根據(jù)點(diǎn)突變?cè)噭┖械囊?，設(shè)計(jì)突變引物（表1）。定點(diǎn)突變PCR反應(yīng)體系：pPIC9K/egⅠ 100 ng，5×TransStart FastPfu Fly Buffer 10 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，TransStart FastPfu Fly DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至50 μL。反應(yīng)程序：94℃ 2 min;94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 3 min，25個(gè)循環(huán);72℃ 10 min，4℃保存。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳， 剩余產(chǎn)物加入1 μL DMT酶，混勻，37℃處理1 h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans -T1，挑單斑進(jìn)行PCR驗(yàn)證，反應(yīng)體系與反應(yīng)程序同上。PCR反應(yīng)陽(yáng)性者測(cè)序，測(cè)序正確后提取質(zhì)粒。

1.5 重組質(zhì)粒和突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子篩選和表型鑒定

重組質(zhì)粒和突變質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ線性化酶切，酶切產(chǎn)物分別通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，轉(zhuǎn)化后在MD平板上28℃培養(yǎng)，待出現(xiàn)單斑后用G418 （1、2、3、4 mg/mL） 進(jìn)行篩選、檢測(cè)，獲得拷貝數(shù)較高的菌株，利用通用引物3′AOX1、5′AOX1 進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白的分離純化

將測(cè)序正確的兩類酵母工程菌株分別接種于BMGY培養(yǎng)基，28℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，離心并將菌體轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min培養(yǎng)7 d，每隔12 h甲醇誘導(dǎo)一次，8 000 r/min離心獲取上清液。上清液中加入硫酸銨至90%飽和并于4℃下靜置過(guò)夜、離心，適量PBSA緩沖液透析，后經(jīng)HisTrap HP柱純化。純化后酶液一部分進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，剩余部分進(jìn)行酶性質(zhì)測(cè)定。

1.7 酶性質(zhì)測(cè)定

1.7.1 酶活力 采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定[10]，DNS法[11]測(cè)定酶活性。酶促反應(yīng)體系：0.1 mg/mL純化酶液100 μL，10 mg/mL CMC-Na溶液100 μL，0.2 mol/L HAc-NaAC緩沖液（pH=5.0） 100 μL，混勻后50℃孵育30 min，后加入300 μL DNS溶液沸水煮10 min，立即冰浴，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光值，測(cè)定酶活力，計(jì)算酶的比活力。

1.7.2 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù) 配制濃度分別為4、6、8、10、12 mg/mL的CMC-Na溶液。酶促反應(yīng)體系同1.7.1。根據(jù) Lineweaver-Burk作圖法，計(jì)算米氏常數(shù) （Km）、催化常數(shù) （kcat）及kcat/Km。

1.7.3 酶最適反應(yīng)溫度 取0.1 mg/mL純化酶液100 μL、0.2 mol/L HAc-NaAC緩沖液（pH=5.0） 100 μL、10 mg/mL的CMC-Na溶液100 μL混勻，分別置于40、50、60、70、80℃下孵育30 min，測(cè)定原酶WT和突變酶在不同溫度下的酶活力，以最高酶活力作為100%，其它酶活力換算為相對(duì)酶活力。

1.7.4 酶反應(yīng)最適pH值 將0.1 mg/mL純化酶液100 μL、10 mg/mL CMC-Na溶液100 μL混勻后分別加入100 μL pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的0.2 mol/L HAc-NaAC緩沖液，50℃下孵育30 min，測(cè)定酶活力，以最高酶活力作為100%，其它酶活力換算為相對(duì)酶活力。

1.7.5 酶熱穩(wěn)定性 將0.1 mg/mL純化酶液100 μL 分別在40、50、60、70、80℃下處理2 h，加入0.2 mol/L HAc-NaAC緩沖液（pH=5.0） 100 μL、10 mg/mL的CMC-Na溶液100 μL，混勻后于50℃孵育30 min，測(cè)定酶活力，以最高酶活力作為100%，其它酶活力換算為相對(duì)酶活力。

1.8 原酶和突變酶三維結(jié)構(gòu)模擬及分析

將WT和各突變酶的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL網(wǎng)站 （http：//swissmodel.expasy.org/） 進(jìn)行三維建模，用PYMOL軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 egⅠ基因的克隆

嗜熱革節(jié)孢經(jīng)總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增后，得到約870 bp的基因片段，如圖1所示，與理論值大小相符。序列測(cè)序結(jié)果表明，編碼EG Ⅰ成熟肽鏈的序列由870個(gè)核苷酸組成，擴(kuò)增得到的序列與egⅠ基因的相似度為99%。

2.2 酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

將構(gòu)建好的酵母工程菌株于BMMY中培養(yǎng)，后將酶蛋白分離純化，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。如圖2所示，試驗(yàn)獲得了較高純度的酶液，蛋白分子量為40 kD，較理論值 （30 kD） 稍大，推測(cè)原因是酶蛋白在異源表達(dá)過(guò)程中進(jìn)行了糖基化修飾;將WT序列提交在線糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)服務(wù)器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）進(jìn)行檢測(cè)，顯示存在糖基化修飾。

2.3 酶性質(zhì)的測(cè)定及分析

2.3.1 酶的比活力以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析 由表2可以看出，與WT相比，突變酶的活性均有所降低，其中R7A、R7C、R7D、R7H、R7M的比活力分別為WT的79%、57%、68%、77%、56%，其它突變酶的比活力均為WT的50%以下，而R7P、R7W僅為WT的22%、24%。Km可近似地表示酶與底物親和力的大小，Km越小，表示親和力越大。

與原酶相比，除R7A外各突變酶Km均有顯著性增大，說(shuō)明只有突變酶R7A對(duì)底物的親和力有所提高;kcat可表示酶催化底物的能力，突變酶R7P的kcat與原酶相比有顯著性提高，表明突變酶R7P提高了產(chǎn)物的釋放效率;kcat/Km可用來(lái)衡量酶的催化效率，雖然個(gè)別突變酶的Km、kcat有所增大，但與原酶相比，突變酶的kcat/Km都顯著性降低，說(shuō)明突變降低了酶的催化效率，從而導(dǎo)致酶活性降低。

2.3.2 突變對(duì)酶最適反應(yīng)溫度的影響 由表3可以看出，WT 的最適反應(yīng)溫度為50℃，突變酶R7C、R7P和R7V 的則為40℃，其它突變酶的均為50℃。說(shuō)明在一定程度上R7的突變會(huì)改變酶的最適溫度。

2.3.3 突變對(duì)酶反應(yīng)最適pH值的影響 由表4可知，不同酶促反應(yīng)中，WT 的最適pH 值為5.0，而突變酶R7C的為6.0，其余突變酶的最適pH值均為5.0。說(shuō)明R7C的突變改變了酶促反應(yīng)的最適pH值，推測(cè)可能是由于突變導(dǎo)致活性中心的電荷分布發(fā)生變化，影響了反應(yīng)的最適pH值。

2.3.4 突變對(duì)酶熱穩(wěn)定性的影響 由表5可以看出，WT具有較高的熱穩(wěn)定性，于70℃下處理2 h仍具有61.73%的活性，突變酶R7F、R7H 的熱穩(wěn)定性明顯高于WT，相同處理?xiàng)l件下具有70%以上的活性，而R7A僅剩20.25%的活性，熱穩(wěn)定性明顯下降，其它突變酶仍具有40%左右的活性。

2.4 三維建模及對(duì)比

根據(jù)Davies 等[12]1996年建立的構(gòu)建WT三維模型 （PDB：1HD5）的方法，分別將剩余19種突變酶的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服務(wù)器獲得三維結(jié)構(gòu)模型。將WT、R7A、R7C、R7D、R7H、R7M、R7P和R7W（圖3）進(jìn)行比較分析可知，R7的突變使酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合發(fā)生變化，從而影響了酶的催化效率。

3 討論與結(jié)論

Doucet等[13]利用點(diǎn)飽和突變技術(shù)對(duì)大腸桿菌的β-內(nèi)酰胺酶Tyr105進(jìn)行點(diǎn)飽和突變， 表明Tyr105能提高酶的底物親和能力;Gabor等[14]對(duì)青霉素酰化酶進(jìn)行點(diǎn)飽和突變，獲得活性提高的突變子;Miyazaki等[15]對(duì)枯草芽孢桿菌蛋白酶進(jìn)行點(diǎn)飽和突變，獲得熱穩(wěn)定性明顯提高的突變子。因此，蛋白質(zhì)工程中點(diǎn)飽和突變技術(shù)較定點(diǎn)突變技術(shù)更有優(yōu)勢(shì)，可更大概率獲得進(jìn)化子。本研究中，對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶的Arg7進(jìn)行飽和突變，能夠更深入探究Arg7突變對(duì)酶性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響。

研究表明，GH45家族的內(nèi)切葡聚糖酶催化機(jī)理是轉(zhuǎn)化底物的異頭構(gòu)型[12]。通過(guò)對(duì)特異腐質(zhì)霉纖維二糖復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行識(shí)別，得出Asp121、Asp10分別作為催化的酸和堿，并且這兩種殘基是第45家族酶的所有序列中唯一完全保守的酸性殘基[8，12]。Davies等[12]認(rèn)為Asp121是催化質(zhì)子供體，位于疏水為主的環(huán)境中，一側(cè)是Ala73和Ala74的疏水側(cè)鏈，同時(shí)它還是與Thr6的羥基相互作用的氫鍵的組成部分。根據(jù)R7A的三維結(jié)構(gòu)模型分析，Arg7突變?yōu)楸彼岷笥锌赡軙?huì)增加催化中心周圍環(huán)境的疏水性，使活性中心與底物結(jié)合更緊密。這種酶的底物結(jié)合槽有所不同，它沒(méi)有與糖作用的芳香族殘基形成的通道[16]，在其底物結(jié)合槽上僅發(fā)現(xiàn)Trp18一個(gè)芳香族殘基，而且底物結(jié)合槽內(nèi)有可能存在氫鍵[17]。芳香族氨基酸能夠參與疏水堆積表面的形成，使纖維長(zhǎng)鏈更易進(jìn)入催化中心[18]，而纖維素酶與纖維素的結(jié)合主要是依靠氫鍵和疏水作用[19]。本試驗(yàn)中，將Arg7 突變?yōu)榉枷阕灏被岷蟛](méi)有達(dá)到預(yù)期效果，活性沒(méi)有提高，反而降低了酶與底物的結(jié)合能力和產(chǎn)物的釋放效率，推測(cè)原因可能是氨基酸側(cè)鏈發(fā)生了變化，從而對(duì)催化活性產(chǎn)生影響。

熱穩(wěn)定性高的纖維素酶在拓寬工業(yè)用酶的用途中非常重要。De Souza 等[20]發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定性提高可以歸因于更多數(shù)量的螺旋和鹽橋，它們?cè)诖呋诵闹酗@示出正電荷，從而穩(wěn)定三級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性主要是疏水作用、二硫鍵、鹽橋和氫鍵幾種力的同時(shí)作用，這些相互作用導(dǎo)致多肽鏈的靈活性降低[21，22]。GH45家族的內(nèi)切葡聚糖酶中有七對(duì)二硫鍵，研究表明二硫鍵在纖維素酶的熱穩(wěn)定性中起著重要作用[23，24]。本研究發(fā)現(xiàn)，原酶具有較高的熱穩(wěn)定性，突變酶R7F的熱穩(wěn)定性提高的原因可能是突變R7F的芳香族側(cè)鏈與周圍的氨基酸發(fā)生疏水作用。WT 的最適反應(yīng)溫度和最適pH值分別為50℃和5.0。這與報(bào)道[25]的GH45家族的其余纖維素酶相似。

本研究克隆并表達(dá)了嗜熱革節(jié)孢GH45家族內(nèi)切葡聚糖酶基因egⅠ，同時(shí)對(duì)Arg7進(jìn)行飽和突變并進(jìn)行了酶性質(zhì)測(cè)定。發(fā)現(xiàn)突變酶的活性較原酶均有所降低，只有突變酶R7A與底物的結(jié)合力有所提高;突變酶R7P提高了產(chǎn)物的釋放效率;突變酶R7C、R7P和R7V的最適反應(yīng)溫度，R7C的最適反應(yīng)pH值發(fā)生改變;在熱穩(wěn)定性方面，只有突變酶R7F、R7H的明顯提高。本研究更深入地探究了Arg7突變對(duì)酶性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響，可為下一步的纖維素酶研究提供參考。

參 考 文 獻(xiàn)：

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