液體發(fā)酵高產(chǎn)納豆激酶菌株的復(fù)合誘變選育

陳曉飛， 向凌云， 李珊珊， 馮 菲， 刁文濤， 周伏忠

（河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450008）

納豆激酶（Nattokinase，NK）是1987年日本學(xué)者Sumi等［1］從日本納豆中分離到的一種絲氨酸蛋白酶［2-3］，與傳統(tǒng)的溶栓劑相比，該酶具有不易引起出血、無(wú)抗原性、半衰期長(zhǎng)、安全無(wú)毒、成本低廉及口服有效等諸多優(yōu)點(diǎn)［4-5］，有望成為臨床上新一代的溶栓藥物. 國(guó)內(nèi)目前關(guān)于NK的報(bào)道，大多是通過(guò)固體發(fā)酵的方法制備納豆、納豆膠囊、納豆粉等保健食品，但固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分復(fù)雜，對(duì)下游的提純等操作非常不利，NK的純化是其作為臨床溶栓藥物的前提，所以目前國(guó)內(nèi)還無(wú)法將NK應(yīng)用于臨床；而液體發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，易控制、規(guī)模易擴(kuò)大，適合工業(yè)化生產(chǎn)，且最重要的是有利于后期的純化處理［6-7］，但目前我國(guó)的相關(guān)報(bào)道中，NK液體發(fā)酵酶活相對(duì)較低（大多在1000 U/mL以下），還不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求，因此獲得高產(chǎn)菌株和液體發(fā)酵工藝，是目前NK研發(fā)的熱點(diǎn).

通過(guò)誘變進(jìn)行菌種選育，是改善微生物生產(chǎn)特性、提高產(chǎn)量的重要技術(shù)手段，也是在較短時(shí)間內(nèi)獲得有價(jià)值突變體的有效方法［8-10］. 本研究通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的NK菌株進(jìn)行紫外-亞硝基胍-Co60混合誘變技術(shù)的方法，選育出5株產(chǎn)NK活性高的突變株，經(jīng)8次傳代后5株菌液體發(fā)酵產(chǎn)NK活性分別達(dá)到了1 846.15、1 956.48、2 184.32、1 865.38和2 095.23U/mL，是復(fù)合誘變出發(fā)菌株的1.62、1.81、1.98、1.61、1.62倍，為液體發(fā)酵生產(chǎn)NK的工業(yè)化奠定了良好的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 本實(shí)驗(yàn)所用NK 生產(chǎn)菌株，為實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株和市售豆豉、黃豆醬和豆腐乳中篩選的產(chǎn)NK菌株.

1.1.2 主要試劑 牛纖維蛋白原、凝血酶和標(biāo)準(zhǔn)尿激酶，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，亞硝基胍（CNS號(hào)：674-81-7）為北京華越洋生物科技有限公司產(chǎn)品，脫脂奶粉為市售紐仕蘭脫脂奶粉，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.1.3 培養(yǎng)基 酪蛋白培養(yǎng)基配方參考黃俊等［11］的方法略有改動(dòng)：干酪素4.0 g、Na2HPO41.3 g、KH2PO40.36 g、NaCl 0.1 g、MgSO40.1 g、葡萄糖1 g、瓊脂15 g，加水800 mL 溶解后調(diào)pH7.2，后定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min.

種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，加水定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min.

牛奶培養(yǎng)基參考耿芳等［12］的方法稍加修改：脫脂奶粉10 g 溶于100 mL 水，瓊脂4 g 溶于100 mL 水，115 ℃滅菌15 min，待溫度降至55 ℃左右時(shí)，牛奶和瓊脂迅速混合倒平板.

液體發(fā)酵培養(yǎng)基［13］：大豆蛋白胨25 g，葡萄糖20 g，MgSO40.5 g，CaCl20.2 g，K2HPO42 g，KH2PO41 g，加水800 mL溶解后調(diào)pH7，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 誘變用納豆激酶生產(chǎn)菌株的篩選 本試驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)室保藏的NK生產(chǎn)菌株和市售豆豉、黃豆醬、豆腐乳的NK生產(chǎn)菌株，通過(guò)酪蛋白培養(yǎng)基初篩，液體發(fā)酵后點(diǎn)樣牛奶培養(yǎng)基復(fù)篩的方法，篩選產(chǎn)NK活性較高的菌株，作為復(fù)合誘變出發(fā)菌株.

1.2.2 紫外誘變 紫外誘變參考薛健等［14］的方法略有改動(dòng)，取1.2.1篩選的菌株，接種于液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min、過(guò)夜培養(yǎng)后，重新轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中（接種量1%），培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（約5 h）收集菌體，鏡檢觀察菌體形態(tài)后，8000 r/min離心5 min收集菌體，生理鹽水洗滌3次，再用生理鹽水將菌體細(xì)胞稀釋為107～108個(gè)/mL的菌懸液. 20 W紫外燈，預(yù)熱30 min后，取制備好的菌懸液10 mL 移入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)（含一無(wú)菌轉(zhuǎn)子），置于紫外燈下30 cm處的磁力攪拌器上，開啟培養(yǎng)皿蓋，在攪拌的條件下，分別在紫外燈下照射60、90、120、150 s，取0.5 mL 的誘變菌懸液加入到無(wú)菌試管中，避光冰浴1 h，將冰浴后的菌液適當(dāng)稀釋，取0.1 mL 涂布于牛奶培養(yǎng)基上，每一處理做3個(gè)平行，同時(shí)將未經(jīng)誘變的菌液涂布作為空白對(duì)照，用黑布包好37 ℃避光培養(yǎng)24 h，計(jì)算致死率. 同時(shí)挑選透明圈較大的菌落進(jìn)行液體發(fā)酵復(fù)篩，篩選產(chǎn)NK活性較高的菌株，作為亞硝基胍誘變的出發(fā)菌株.

1.2.3 亞硝基胍誘變 亞硝基胍誘變參考劉文玉等［15］的方法稍加修改，取紫外誘變選育的產(chǎn)NK活性相對(duì)較高的菌株，按上述方法培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，鏡檢觀察菌體形態(tài)后收集菌體，用滅菌的0.1 M、pH7.0的磷酸鈉鹽緩沖液（PBS）洗滌菌體后，重新懸浮于0.1 M PBS緩沖液中（細(xì)菌濃度：107～108個(gè)/mL），加入2 mg/mL亞硝基胍（NTG）溶液（用上述PBS配制），使其終濃度為0.2 mg/mL，35 ℃、150 r/min搖床誘變1 h后，用0.1 M、pH7.0 PBS洗滌3次除去NTG，菌體重懸于PBS，適當(dāng)稀釋后涂牛奶平板（以不加NTG的菌液對(duì)照），篩選正向突變株，并進(jìn)行液體發(fā)酵復(fù)篩，經(jīng)過(guò)8次傳代穩(wěn)定后，篩選3～5株產(chǎn)NK活性較高的菌株，作為Co60誘變的出發(fā)菌株.

1.2.4 Co60誘變 Co60誘變參考李檢秀等［16］的方法，將NTG誘變選育的菌株，按照1.2.2的方法培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用生理鹽水洗滌菌體3次后，用生理鹽水將菌體細(xì)胞稀釋為107～108個(gè)/mL的菌懸液，后用劑量分別為200、400、600、800、1000 Gy的Co60輻照，輻照后梯度稀釋涂牛奶平板，以不進(jìn)行Co60輻照的菌液作為對(duì)照，計(jì)算致死率，并選育正向突變的菌株；后通過(guò)液體發(fā)酵復(fù)篩的方法，并經(jīng)8次以上傳代進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證穩(wěn)定后，最終選育出生產(chǎn)NK活性高的菌株.

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變育種出發(fā)菌株篩選

從市售豆豉、黃豆醬、豆腐乳中，初篩共分離出153株納豆激酶生產(chǎn)菌，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室保藏的35納豆激酶高產(chǎn)菌株，經(jīng)液體發(fā)酵復(fù)篩，獲得5株產(chǎn)NK活性相對(duì)較高的菌株（表1），作為誘變育種的出發(fā)菌株，這5株菌經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基37 ℃發(fā)酵48 h后，NK活性均可達(dá)到1000 U/mL.

表1 誘變育種出發(fā)菌株篩選結(jié)果Tab.1 Screening results of starting strains for mutation breeding

2.2 紫外誘變選育結(jié)果

表1中的5株菌（LJJ-1、PXDBJ-13、DNS-17、CBL-2、L）經(jīng)過(guò)紫外誘變選育，獲得13株液體發(fā)酵后NK活性顯著增加的正向突變株，經(jīng)8次傳代后發(fā)酵NK活性見表2.

表2 紫外誘變正向突變株8次傳代液體發(fā)酵NK活性Tab.2 NK activities in liquid fermentation of forward mutants by UV mutagenesis in eight generations 單位：U/mL

從表2可以看出，13株產(chǎn)NK正向突變菌株經(jīng)過(guò)8次傳代后，只有DNS-17-6和L-11的液體發(fā)酵產(chǎn)NK活性（958.08 U/mL和1 089.41 U/mL）較未經(jīng)紫外誘變的出發(fā)菌株（991.23 U/mL和1 096.52 U/mL）低，其余11株菌NK生產(chǎn)能力均高于出發(fā)菌株，但經(jīng)過(guò)8次傳代后，多數(shù)NK生產(chǎn)能力下降明顯，而突變株LJJ-1-13、PXDBJ-13-9、PXDBJ-13-15、DNS-17-3、CBL-2-7、CBL-2-12和L-5，經(jīng)8次傳代后，產(chǎn)NK能力仍顯著高于其出發(fā)菌株（分別較出發(fā)菌株提高27.1%、44.3%、30.2%、40.8%、36.6%、29.5%、27.8%），結(jié)合出發(fā)菌株（盡量每個(gè)出發(fā)菌株選育出1株突變株），確定LJJ-1-13、PXDBJ-13-9、DNS-17-3、CBL-2-7和L-5等5株，作為后續(xù)NTG誘變育種的出發(fā)菌株.

2.3 亞硝基胍誘變育種結(jié)果

經(jīng)過(guò)NTG誘變，每個(gè)出發(fā)菌株從大量的突變株中篩選出2～3株明顯的正向突變株，經(jīng)過(guò)8次傳代后，其液體發(fā)酵產(chǎn)NK活性見圖1.

圖1 NTG誘變篩選菌株液體發(fā)酵NK活性Fig.1 NK activities of NTG mutant strains in liquid fermentation

由圖1可以看出NTG誘變選育的菌株，經(jīng)過(guò)8次傳代后，有兩株菌（CBL-2-7-3和L-5-11）穩(wěn)定性較差，液體發(fā)酵產(chǎn)NK 活性較出發(fā)菌株低，其余菌株的NK 活性均高于出發(fā)菌株，結(jié)合出發(fā)菌株，選LJJ-1-13-12、PXDBJ-13-9-7、DNS-17-3-15、CBL-2-7-10 和L-5-8（液體發(fā)酵產(chǎn)NK 活性分別較出發(fā)菌株高21.7%、14.9%、16.8%、14.9%、14.2%）作為Co60誘變的出發(fā)菌株.

2.4 Co60誘變育種結(jié)果

Co60誘變后，選育出14株正向突變株，經(jīng)過(guò)8次傳代后，液體發(fā)酵產(chǎn)NK活性見圖2.

圖2 誘變篩選菌株液體發(fā)酵NK活性Fig.2 NK activities of mutant strains in liquid fermentation

由圖2 可以看出Co60誘變選育的菌株，經(jīng)過(guò)8 次傳代后，有3 株（PXDBJ-13-9-7-5 和CBL-2-7-10-11、L-5-8-2）液體發(fā)酵產(chǎn)NK活性較出發(fā)菌株低，其余菌株的NK活性均高于出發(fā)菌株，結(jié)合出發(fā)菌株，選育出5株產(chǎn)NK活性高的突變株（LJJ-1-13-12-4、PXDBJ-13-9-7-18、DNS-17-3-15-7、CBL-2-7-10-6和L-5-8-15），經(jīng)8次傳代后其菌液體發(fā)酵產(chǎn)NK活性分別為1 846.15、1 956.48、2 184.32、1 865.38、2 095.23 U/mL，與Co60誘變出發(fā)菌株比，液體發(fā)酵產(chǎn)NK活性均顯著提高（分別提高12.2%、11.7%、45.8%、11.3%、30.7%），同時(shí)，其產(chǎn)NK活性是5株復(fù)合誘變?cè)汲霭l(fā)菌株（LJJ-1、PXDBJ-13、DNS-17、CBL-2、L）的1.62、1.81、1.98、1.61、1.62倍.選育的5株突變株與其出發(fā)菌株發(fā)酵液在纖維平板上產(chǎn)生的溶解圈見圖3.

圖3 選育的突變株與其出發(fā)菌株發(fā)酵液在纖維平板上產(chǎn)生的溶解圈Fig.3 Dissolving rings produced on the fiber plate by the fermentation liquid of selected mutants and whose starting strains

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)篩選的5株誘變育種原始出發(fā)菌株LJJ-1、PXDBJ-13、DNS-17、CBL-2、L，經(jīng)過(guò)紫外誘變后，獲得的5株突變株LJJ-1-13、PXDBJ-13-9、DNS-17-3、CBL-2-7和L-5，經(jīng)過(guò)8次傳代后突變株穩(wěn)定性較好，且產(chǎn)NK 活性較出發(fā)菌株顯著提高（分別提高了27.1%、44.3%、40.8%、36.6%、27.8%），說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)紫外誘變提高NK 產(chǎn)量的效果顯著. 而以LJJ-1-13、PXDBJ-13-9、DNS-17-3、CBL-2-7 和L-5 為出發(fā)菌株經(jīng)NTG 誘變篩選的5株突變株LJJ-1-13-12、PXDBJ-13-9-7、DNS-17-3-15、CBL-2-7-10和L-5-8，雖然產(chǎn)NK活性也顯著提高（分別較出發(fā)菌株高21.7%、14.9%、16.8%、14.9%、14.2%），但與紫外誘變相比，效果相對(duì)較差，該結(jié)果與張春玲［17］的報(bào)道有所不同，這可能與NTG 誘變的出發(fā)菌株本身NK 活性相對(duì)較高有關(guān). Co60誘變選育的5株突變株LJJ-1-13-12-4、PXDBJ-13-9-7-18、DNS-17-3-15-7、CBL-2-7-10-6和L-5-8-15，NK生產(chǎn)能力分別為1 846.15、1 956.48、2 184.32、1 865.38、2 095.23 U/mL，較出發(fā)菌株高12.2%、11.7%、45.8%、11.3%、30.7%，也似乎印證了這一觀點(diǎn)（除DNS-17-3-15-7和L-5-8-15產(chǎn)NK活性較出發(fā)菌株提高得較多之外，其余3突變株均較出發(fā)菌株提高12%左右）.

經(jīng)過(guò)紫外-亞硝基胍-Co60復(fù)合誘變后得到的突變株LJJ-1-13-12-4、PXDBJ-13-9-7-18、DNS-17-3-15-7、CBL-2-7-10-6 和L-5-8-15，液體發(fā)酵產(chǎn)NK 活性分別是誘變前原始出發(fā)菌株LJJ-1、PXDBJ-13、DNS-17、CBL-2和L產(chǎn)NK活性的1.62、1.81、1.98、1.61、1.62倍，為1 846.15、1 956.48、2 184.32、1 865.38和2 095.23 U/mL，與余夢(mèng)等［18］、錢澤棟［19］和張琳等［20］報(bào)道的最高酶活（分別為1436、1 598.13和1004 IU/mL）相比，本實(shí)驗(yàn)選育的突變株產(chǎn)NK優(yōu)勢(shì)突出，從而為NK液體發(fā)酵的工業(yè)化奠定了良好的基礎(chǔ).