清痹片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳清波

（泰安市泰山區(qū)疾病預(yù)防控制中心 山東泰安 271000）

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；色譜柱 Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；CAMAG LINO MAT5 型薄層色譜半自動(dòng)點(diǎn)樣儀；薄層成像系統(tǒng):CAMAG TLC Visualizer；超純水機(jī):細(xì)胞型1810A（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）；BS210S電子分析天平（德國賽多利斯）；KQ-600DB超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；硅膠G薄層板（天津思利達(dá)科技有限公司）。

1.2 材料

綠原酸（121208-201305）、羌活對照藥材（1209 35-201408）（中國食品藥品檢定研究院）；清痹片（0.3 g/片，批號(hào) 170426、170518、170622）以及陰性樣品（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）；乙腈（CH3CN）（色譜純）（SIGMA 公司）；純化水；甲酸（HCOOH）、甲醇（CH3OH）、乙酸 乙 酯 （C4H8O2）、磷酸 （H3PO4）、乙 醚（C4H10O）（分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜法（TLC）鑒別

2.1.1 金銀花的鑒別

取清痹片20片，研細(xì)，過2號(hào)篩，稱取粗粉約3g，加入CH3OH 20 mL，超聲波提取1 h，過濾，濾液加熱濃縮至約10 mL，作為供試品溶液。取綠原酸對照品，加CH3OH制成1 mg/mL溶液，作為對照品溶液。按照《中華人民共和國藥典》（2015年版）通則0502試驗(yàn)，分別吸取上述2種溶液5 μL，點(diǎn)于同一塊硅膠 G 薄層板上，以 C4H8O2-HCOOH-水（10∶0.5∶0.5）為展開劑展開、取出、晾干，在紫外燈（365 nm）下檢視[1-5]。結(jié)果顯示，供試品TLC色譜（薄層色譜）在與對照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，詳見圖1。

圖1 金銀花TLC色譜圖

2.1.2 羌活的鑒別

取清痹片10片，研細(xì)，過2號(hào)篩，稱取粗粉約3g，加入CH3OH 20 mL，超聲波提取1 h，靜置，過濾，濾液加熱濃縮至5 mL，作為供試品溶液。另外，稱取羌活對照藥材約2 g，加入CH3OH 10 mL，同法制成對照藥材溶液。按照《中華人民共和國藥典》（2015年版）通則0502試驗(yàn)規(guī)定，分別吸取上述2種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30℃～60℃）-C4H10O-HCOOH（10∶10∶0.5） 為展開劑展開，取出，晾干，在紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜與對照藥材色譜在3處相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，詳見圖2。

2.2 綠原酸含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱 Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:CH3CN-0.1%H3PO4溶液（10∶90）；體積流量 1.0 mL/min；柱溫 30°C；檢測波長 327 nm；進(jìn)樣10μL；理論塔板數(shù)按綠原酸計(jì)算應(yīng)不低于1000。

2.2.2 溶液的制備

（1）供試品溶液:取適量清痹片，研成細(xì)粉，過4號(hào)篩，精密稱取粉末約0.5 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入50 mL含量為50%的CH3OH溶液，密塞搖勻，稱重，超聲波提取1 h，放冷，再次稱重，加入適量CH3OH溶液補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，過0.45 μm 微孔濾膜，備用。

（2）對照品溶液:精密稱取綠原酸對照品，加CH3OH制成1.55 mg/mL對照品溶液，再精密量取1 mL，在10 mL的容量瓶中定容，過0.45 μm微孔濾膜，得到濃度為155.00 μg/mL的對照品溶液。

（3）陰性供試品溶液:按照清痹片的處方及制法制成缺少金銀花藥材的陰性樣品，再按（1）中制備方法制成陰性供試品溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn)

按照上述色譜條件，精密吸取3種溶液，分別注入Agilent 1200高效液相色譜儀中測定。數(shù)據(jù)顯示，供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)的位置上出現(xiàn)色譜峰，而陰性樣品色譜的相應(yīng)位置上未出現(xiàn)色譜峰，說明在該測定條件下，無明顯干擾，可用于綠原酸檢測。

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的綠原酸對照品溶液（155.00 μg/mL），分別置于 5 mL 容量瓶中，加CH3OH稀釋定容至刻度，制得濃度分別為31.00、62.00、93.00、124.00、155.00 μg/mL 的對照品溶液，精密吸取上述溶液各10 μL，注入Agilent 1200高效液相色譜儀中，按色譜條件進(jìn)行測定。以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=12.36091X-6.83524，r2=0.9991表明綠原酸在31.00~155.00 μg/mL的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，詳見表1。

圖2 羌活TLC色譜圖

表1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

2.2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液 10 μL（155.00 μg/mL），重復(fù)進(jìn)樣6次，測得綠原酸峰面積分別為1 544.650 3、1 539.115 5、1 553.699 2、1 545.090 7、1 545.539 3、1545.1058 mAU·min，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=6）為 0.30%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（170426）6份，每份約 0.5 g，精密稱定，按（1）中方法制成供試品溶液，分別測定綠原酸的含量，結(jié)果顯示綠原酸平均含量為8.179 6 mg/g，RSD（n=6）為0.23%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品溶液（170426），分別在第 0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，測得綠原酸峰面積的RSD為0.66%，表明供試品溶液中綠原酸在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的供試品6份（170426），每份約0.5 g，再分別精密加入適量的綠原酸對照品，按（1）中方法制備供試品溶液，測定回收率，詳見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.9 樣品含量測定

取樣品適量，按（1）中方法制備供試品溶液，在色譜條件下進(jìn)行測定，測得3批樣品中綠原酸含量分別為:8.479 0、8.395 6、8.301 3 mg/g，詳見表 3。

表3 綠原酸含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

經(jīng)過數(shù)年的臨床應(yīng)用，清痹片已經(jīng)成為山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕、痛風(fēng)及增生性關(guān)節(jié)炎的常用藥。為了保證該制劑的質(zhì)量，確保臨床安全有效，本文對清痹片中君藥金銀花、臣藥羌活進(jìn)行了TLC定性鑒別，對TLC條件進(jìn)行了優(yōu)化，依據(jù)藥典中羌活鑒別的展開方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)供試品的分離效果較差，故選擇了石油醚（30℃～60℃）-C4H10OHCOOH（10∶10∶0.5）為展開劑。優(yōu)化后的 TLC 條件專屬性較強(qiáng)，分離度好，樣品和綠原酸在同一位置顯示相同顏色的斑點(diǎn)，與羌活對照藥材在3處相同的位置顯示同樣的斑點(diǎn)。同時(shí)，本文也對處方中的蒲公英和川牛膝進(jìn)行了定性鑒別，但由于分離效果不佳以及在對照品位置沒有產(chǎn)生相應(yīng)的斑點(diǎn)等原因，未收錄到正文中。

本文建立了清痹片中君藥金銀花主要成分綠原酸的高效液相色譜法（HPLC）含量測定方法，有效地控制了成品質(zhì)量，HPLC色譜條件專屬性強(qiáng)，僅綠原酸一種成分被洗脫出來，與其對照品在相同的保留時(shí)間出峰，操作簡便，重復(fù)性好，可以作為檢測清痹片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法。