化妝品微生物檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證分析與探討

張明君 楊玲玲 李小燕 顧金花

（新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院 新疆烏魯木齊 830000）

1 前言

能力驗(yàn)證是通過(guò)實(shí)驗(yàn)室之間特定的檢測(cè)數(shù)據(jù)比對(duì)，確定其對(duì)檢驗(yàn)項(xiàng)目的檢測(cè)能力[1，2]。中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）將能力驗(yàn)證作為一種評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力的考察指標(biāo)，與現(xiàn)場(chǎng)評(píng)審考核共同構(gòu)成能力評(píng)價(jià)技術(shù)[3]，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量活動(dòng)中檢測(cè)、校準(zhǔn)、檢查等領(lǐng)域的一項(xiàng)重要內(nèi)容[4-6]。實(shí)驗(yàn)室把能力驗(yàn)證作為一種質(zhì)量保證，對(duì)檢測(cè)持續(xù)進(jìn)行監(jiān)控。因此，評(píng)價(jià)檢測(cè)機(jī)構(gòu)是否具備化妝品微生物檢驗(yàn)?zāi)芰?，可以通過(guò)開(kāi)展化妝品微生物檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證對(duì)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)水平進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)室可以通過(guò)參加能力驗(yàn)證，明確與其他實(shí)驗(yàn)室之間的差異，監(jiān)督和改進(jìn)自身檢測(cè)能力，對(duì)所用方法及儀器進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)部質(zhì)控，持續(xù)改進(jìn)和完善自身質(zhì)量管理體系。

能力驗(yàn)證的結(jié)果可以多種形式體現(xiàn)，分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)與數(shù)據(jù)類型相適應(yīng)[7-10]。2018年，本實(shí)驗(yàn)室參加了由中國(guó)食品藥品檢定研究院組織的化妝品中微生物檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證，取得了滿意結(jié)果。通過(guò)參加此次能力驗(yàn)證，監(jiān)督檢驗(yàn)過(guò)程的穩(wěn)定性[11，12]，對(duì)提高實(shí)驗(yàn)室的化妝品微生物檢驗(yàn)?zāi)芰τ兴鶐椭?/p>

2 試劑、儀器設(shè)備與檢驗(yàn)方法

2.1 材料

2.1.1 樣品

化妝品微生物檢驗(yàn)項(xiàng)目的能力驗(yàn)證共有4個(gè)項(xiàng)目，每個(gè)項(xiàng)目為2瓶樣品，裝在棕色的西林瓶?jī)?nèi)，內(nèi)含由乳白色膏狀物包裹的1個(gè)白色小球和1個(gè)藍(lán)色小球。對(duì)應(yīng)項(xiàng)目以及樣品標(biāo)識(shí)分別為菌落總數(shù)CODE 0003和CODE0071、耐熱大腸菌群CODE0107和COD E0144、銅綠假單胞菌 CODE0107和 CODE0135、金黃色葡萄球菌CODE0098和CODE011，標(biāo)識(shí)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

2.1.2 試劑

2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）卵磷脂-吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)20170918）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（20170622）、大豆酪蛋白瓊脂（TSA）培養(yǎng)基（20170810）、雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基（2016 1129）、大豆酪蛋白葡萄糖卵磷酯吐溫80（SCDLP）液體培養(yǎng)基（20170512）、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）（2016 1020）、靛基質(zhì)試劑（20180418）、革蘭氏染色液（2018 0330）、溴化十六烷基三甲胺瓊脂（20171206）、1%TTC溶液（20180411）、Baird Parker平板（BP 平板）（2018 0321）、血瓊脂平板（20180405）、兔血漿凝固酶（2017 0823）、氧化酶試劑（20170617）（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）。

2.2 儀器設(shè)備

RT3369型生物安全柜（Thermo公司）；HCP246型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（memmert公司）；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）；CX31型顯微鏡（日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)）。

2.3 檢驗(yàn)方法

按照2018年化妝品微生物檢驗(yàn)項(xiàng)目的能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書(shū)以及《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）[13]的要求，進(jìn)行增菌、分離及鑒定。并采用 VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行菌株鑒定，綜合試驗(yàn)結(jié)果并出具檢驗(yàn)報(bào)告。同時(shí)用金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（CMCC（B）26 003）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（CMCC（B）10 104）作陽(yáng)性對(duì)照，菌株來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)檢定研究院。

2.3.1 操作步驟

前處理按照各自作業(yè)指導(dǎo)書(shū)的要求，在生物安全柜內(nèi)向每個(gè)西林瓶中加入6 mL生理鹽水或者SCDLP液體培養(yǎng)基，將樣品完全溶解并混勻，轉(zhuǎn)移至滅菌試管中，然后用生理鹽水或者SCDLP液體培養(yǎng)基潤(rùn)洗西林瓶4次，每次1 mL，至 10 mL，制成1∶10 的供試液，備用。

2.3.2 菌落總數(shù)檢驗(yàn)

從制備的1∶10供試液中取出1 mL加入到9 mL生理鹽水管中，充分混勻，再稀釋成1∶100和1∶1000的供試液，從每個(gè)稀釋好的供試液中，分別各取出1 mL加入至2個(gè)平皿中，傾入約45℃的TTC-卵磷脂-吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并同法平行做加入TTC溶液和吐溫-80的營(yíng)養(yǎng)瓊脂和TSA培養(yǎng)基，每皿約為15 mL，待完全凝固后，倒置放入36℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h，取出計(jì)數(shù)。同時(shí)用生理鹽水和培養(yǎng)基做空白對(duì)照組，培養(yǎng)計(jì)數(shù)。菌落計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再用5～10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)；若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘2，用以代表全皿菌落數(shù)。

2.3.3 耐熱大腸菌群檢驗(yàn)

將制備的1∶10供試液10 mL，加入到10 mL雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基中，置于44℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，如果既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。同法用生理鹽水和培養(yǎng)基做空白對(duì)照組，如果產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種至EMB培養(yǎng)基上，置于36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑取可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。同時(shí)取培養(yǎng)液1～2滴接種至蛋白胨水培養(yǎng)液中，置于44℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在蛋白胨水培養(yǎng)液里，加入靛基質(zhì)試劑約0.5 mL，觀察其靛基質(zhì)反應(yīng)。經(jīng)培養(yǎng)后，觀察上述平板上有無(wú)典型菌落生長(zhǎng)。耐熱大腸菌群在EMB培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，具有金屬光澤。部分呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；或粉紫色，中心較深的菌落，亦為耐熱大腸菌群，應(yīng)注意挑選。靛基質(zhì)反應(yīng)中，陽(yáng)性反液面呈玫瑰紅色，陰性反應(yīng)液面呈試劑本色，綜合以上檢驗(yàn)判斷得出結(jié)果。

2.3.4 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)

將制備的1∶10供試液10mL，加入至90mL SCDLP液體培養(yǎng)基里混勻，置于36℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h，同時(shí)取出金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26003）菌液1 mL（約 100 CFU/mL），接種至 90 mL SCDLP 液體培養(yǎng)基里，作為陽(yáng)性對(duì)照與樣品用相同方法進(jìn)行檢驗(yàn)?；靹蚺囵B(yǎng)過(guò)的樣品培養(yǎng)物，分別用接種環(huán)取上述培養(yǎng)物1環(huán)，劃線于BP平板及血瓊脂平皿上，置于36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。金黃色葡萄球菌在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈；在BP平板培養(yǎng)基上為圓形，光滑，凸起，濕潤(rùn)，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹(shù)膠的軟度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無(wú)混濁帶及透明帶。從BP平板及血瓊脂平板上，選取典型的菌落，劃線TSA平板進(jìn)行分純，在36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑取分純好的單個(gè)菌落進(jìn)行涂片，再用革蘭氏染色鏡檢，并進(jìn)行甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)與血漿凝固酶試驗(yàn)。同時(shí)挑取單個(gè)的純化好的菌落，用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)。綜合上述的檢驗(yàn)結(jié)果，按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

2.3.5 銅綠假單胞菌檢驗(yàn)

將制備的 1∶10供試液 10 mL，加入至 90 mL SCDLP液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行混勻，在36℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng) 24 h，同時(shí)取出銅綠假單胞菌（CMCC（B）10104）菌液 1 mL（約 100 CFU/mL），接種至 90 mL SCDLP液體培養(yǎng)基里作為陽(yáng)性對(duì)照，與樣品用同法進(jìn)行檢驗(yàn)?；靹蚺囵B(yǎng)過(guò)的樣品培養(yǎng)物，用接種環(huán)在培養(yǎng)液薄膜處，挑取上述增菌液1環(huán)，劃線接種至CTMAB瓊脂平板上，在36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上，其菌落成扁平無(wú)定型，向周邊擴(kuò)散或略有蔓延，表面濕潤(rùn)，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素。從CTMAB瓊脂平板上挑選典型的菌落，劃線TSA平板，在36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，涂片，再進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。從TSA平板上挑出單個(gè)的菌落，用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)。綜合上述的檢驗(yàn)結(jié)果，按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

3 結(jié)果

3.1 菌落總數(shù)

采用3種不同的培養(yǎng)基進(jìn)行比對(duì)，故每個(gè)樣品有6個(gè)處理結(jié)果，詳見(jiàn)表1。最終以TTC卵磷脂-吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿讀數(shù)的平均值為最終結(jié)果。樣品CODE0003計(jì)數(shù)結(jié)果為65000CFU/g，∣Z∣值為 1.12；CODE0071計(jì)數(shù)結(jié)果為 110 000 CFU/g，∣Z∣值為0.69。

表1 菌落總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果（單位：CFU/g）

3.2 耐熱大腸菌群

2個(gè)樣品CODE0107和CODE0144均出現(xiàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的現(xiàn)象，劃線EMB瓊脂平板，菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，具有金屬光澤，為典型菌落。染色鏡檢結(jié)果均為革蘭氏陰性短桿菌；蛋白胨水培養(yǎng)液中靛基質(zhì)反應(yīng)均為陽(yáng)性。因此，2個(gè)樣品結(jié)果均為檢出。

3.3 金黃色葡萄球菌

樣品CODE0098的BP平板上呈現(xiàn)菌落為黑色圓形，周圍有渾濁帶和透明圈，血瓊脂平板上呈現(xiàn)菌落為金黃色圓形，表面光滑，周圍有溶血圈，為典型菌落特征。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性球菌，血漿凝固酶試驗(yàn)在2 h內(nèi)凝固，VITEK 2 Compact系統(tǒng)鑒定結(jié)果為 99%金黃色葡萄球菌。樣品CODE0110的BP平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)。綜合以上結(jié)果，判定樣品CODE0098檢出金黃色葡萄球菌，CODE0110為未檢出。

3.4 銅綠假單胞菌

樣品CODE0135的SCDLP培養(yǎng)液劃線CTMAB平板，其菌落為扁平無(wú)定型，向周邊擴(kuò)散或略有蔓延，表面濕潤(rùn)，呈灰白色，為典型菌落。染色鏡檢結(jié)果均為革蘭氏陰性桿菌。VITEK 2 Compact系統(tǒng)鑒定結(jié)果為99%銅綠假單胞菌。CODE0107的CTMAB瓊脂平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)。綜合以上結(jié)果，判定樣品CODE0135檢出銅綠假單胞菌，CODE0107為未檢出。

4 結(jié)論

根據(jù)中國(guó)食品藥品檢定研究院能力驗(yàn)證結(jié)果通知單，菌落總數(shù)結(jié)果具體判斷原則為2個(gè)濃度樣品結(jié)果均為∣Z∣≤2，或1組樣品的結(jié)果為2<∣Z∣<3。本實(shí)驗(yàn)室菌落總數(shù)的2個(gè)樣品∣Z∣值均符合該判斷原則，結(jié)果均為滿意；耐熱大腸菌群、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌檢驗(yàn)結(jié)果均與指定值一致，結(jié)果均為滿意。

菌落總數(shù)為定量檢測(cè)項(xiàng)目，在完成能力驗(yàn)證基礎(chǔ)上，同時(shí)采用3種培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，比對(duì)其結(jié)果，加入同濃度的TTC溶液[14，15]和吐溫-80的營(yíng)養(yǎng)瓊脂及TSA瓊脂培養(yǎng)基的平皿菌落計(jì)數(shù)較低，而TTC卵磷脂-吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的平皿菌落計(jì)數(shù)最高，以其為最終結(jié)果。同時(shí)進(jìn)行3種培養(yǎng)基的比對(duì)試驗(yàn)，既可驗(yàn)證用TTC卵磷脂-吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基結(jié)果最佳，避免了結(jié)果的少計(jì)漏計(jì)，又可通過(guò)數(shù)據(jù)之間的比對(duì)看出檢驗(yàn)人員的檢驗(yàn)水平，為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制提供保證。

耐熱大腸菌群、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌為定性檢測(cè)項(xiàng)目，本實(shí)驗(yàn)室采取傳統(tǒng)檢驗(yàn)與VITEK 2 Compact系統(tǒng)檢驗(yàn)相結(jié)合的方法，2種檢驗(yàn)方法結(jié)果均一致，增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性。

化妝品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的微生物檢驗(yàn)方法較為傳統(tǒng)，檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，但是檢驗(yàn)步驟較為煩瑣，耗時(shí)費(fèi)力。今后，應(yīng)拓展更多先進(jìn)簡(jiǎn)便的檢驗(yàn)方法，突破以往化妝品檢驗(yàn)方法的局限，提高化妝品檢驗(yàn)的效率以及能力。