鯉皰疹病毒Ⅱ型RAA-LFD檢測方法的建立

王 姝 呂曉楠 徐立蒲 張 文 王靜波 王小亮 曹 歡

（北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站 北京 100176）

1 前言

鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）是能感染金魚和鯽魚并引起造血器官壞死的高致病性病原[1，2]。感染病毒的魚行動遲緩、腹部膨大、體表出血[3]。一旦發(fā)病，死亡率在50%以上，甚至可達90%。CyHV-2首次在日本養(yǎng)殖的金魚體內(nèi)分離出，之后迅速蔓延至美國、中國、澳大利亞、英國等國家[4-6]。該病毒傳入我國后，在鯽魚主養(yǎng)區(qū)暴發(fā)，造成養(yǎng)殖金魚和鯽魚的大批死亡，僅2012年江蘇養(yǎng)殖鯽魚發(fā)病面積就達約3萬ha[7]。

目前，尚無敏感細胞系可用于分離CyHV-2，檢測主要依賴于熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、套式PCR等分子生物學(xué)方法[8，9]。這些方法對檢測人員有較高的技術(shù)要求，且難以實現(xiàn)非實驗室現(xiàn)場的快速檢測及基層普及。為了更好地通過檢測發(fā)現(xiàn)潛在病毒，及時采取防控措施，控制疾病擴散，應(yīng)建立快速、簡便的適用于現(xiàn)場檢測CyHV-2的方法，作為現(xiàn)有方法的有力補充。

重組酶介導(dǎo)擴增法（Recombinase-Aid Amplification，RAA）[10]、重組酶聚合酶擴增法（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）[11]等恒溫核酸擴增技術(shù)，在37℃～39℃下依賴于特異性寡核苷酸引物或探針的側(cè)向流試紙條（Lateral Flow Dipstick，LFD）檢測目的基因片段，具有靈敏度高、特異性強、檢測時間短、肉眼讀取結(jié)果、操作簡便等優(yōu)點。目前，RAA、RPA快速檢測方法已經(jīng)應(yīng)用于雞傳染性喉氣管炎病毒等陸生動物病毒[12，13]以及傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）等水生動物病的原檢測領(lǐng)域[14]。

本研究以RAA技術(shù)為基礎(chǔ)，聯(lián)合膠體金LFD技術(shù)，建立了一種可以在現(xiàn)場快速、準(zhǔn)確檢測CyHV-2的方法，為有效防控CyHV-2提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 主要實驗材料

材料:2012—2017年，在22個北京觀賞魚場采集養(yǎng)殖金魚樣品，每個樣品含10～15尾魚。取每尾魚的腎、脾組織，研磨成組織液，備用。鯉春病毒（SVCV）、鯉浮腫病毒（CEV）、傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、草魚出血病毒（GCRV-9014）、錦鯉皰疹病毒（KHV）、斑點叉尾鮰皰疹病毒（CCV）、流行性造血器官壞死病毒（EHNV）均由本實驗分離保存。

試劑:DNA Blood Mini Kit試劑盒（QIAGEN公司）；RAA核酸擴增試劑（杭州眾測生物技術(shù)有限公司）；2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與定量

由北京華大基因合成CyHV-2的helicase基因序列（1446bp），將其克隆至pUC57載體上，構(gòu)建成標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pUC57-CyHV-2，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度約為10.6ng/μL。該重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定正確后，測定其濃度并根據(jù)公式{質(zhì)粒濃度（ng/μL）×10-9/[660×（質(zhì)粒長度+載體長度）]}×6.023×1023=質(zhì)?？截悢?shù)（拷貝/μL）換算為其拷貝數(shù)。

2.3 引物的設(shè)計與篩選

對GenBank中登錄的CyHV-2的helicase基因序列（參照GenBank Accession AFJ 20501）進行比對，依據(jù)RAA引物設(shè)計原則，采用DNAman 6.0軟件進行序列比對分析，選取同源性高的片段，用primer 5.0進行引物設(shè)計（表1）。以pUC57-CyHV-2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒（8×105拷貝/μL）作為模板，對 RAA 引物進行篩選。擴增反應(yīng)參照試劑盒說明書進行。反應(yīng)條件采用37℃孵育10 min，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RAA產(chǎn)物。選擇擴增條帶單一的1對引物，對上、下游引物5’端分別用異硫氰酸熒光色（FITC）和生物素（Biotin）進行標(biāo)記，合成與標(biāo)記由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，標(biāo)記后的引物用于后續(xù)的方法建立。

表1 用于GFHNV檢測的引物信息

2.4 RAA-LFD方法的優(yōu)化及建立

所有優(yōu)化試驗均以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pUC57-CyHV-2（8×105拷貝/μL）為模板。采用方陣法對標(biāo)記的引物（366-CyHV-2-hel-F/R）的濃度（1、5、10、50、100 μmol/L）、反應(yīng)溫度（25℃、34℃、37℃、40℃、45℃）、反應(yīng)時間（5、10、15、20、25 min）進行優(yōu)化，反應(yīng)體系參照 RAA 試紙條型核酸擴增試劑盒。

所有優(yōu)化試驗的擴增產(chǎn)物均通過LFD檢測。為防止反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生的氣溶膠影響檢測結(jié)果，本研究將50 μL RAA反應(yīng)產(chǎn)物直接放于裝置內(nèi)，與裝置自帶液泡緩沖液充分混合后豎立在水平操作臺上，在3~5 min后觀察并拍照記錄結(jié)果，選擇陽性樣品出現(xiàn)最強檢測線和質(zhì)控線、陰性樣品不出現(xiàn)檢測線僅出現(xiàn)質(zhì)控線時的條件作為RAA-LFD的優(yōu)化條件。

2.5 靈敏度實驗

比較已建立的RAA-LFD檢測方法與CyHV-2的helicase基因標(biāo)準(zhǔn)PCR檢測方法[15]的靈敏度。將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pUC57-CyHV-2進行10倍系列稀釋，濃度從 8.13×100～8.13×108拷貝/μL 的梯度稀釋，分別以其為模板進行RAA-LFD檢測和常規(guī)PCR檢測。

2.6 特異性實驗

利用Qiagen RNA提取試劑盒抽提IHNV、SVCV、GV-9014的核糖核酸（RNA），并將其逆轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的互補脫氧核糖核苷酸（cDNA）。采用Qiagen DNA提取試劑盒抽提CEV、KHV、EHNV、CCV基因組DNA。利用已建立的RAA-LFD檢測方法檢測上述cDNA和DNA。

3 結(jié)果

3.1 引物篩選

根據(jù)RAA的引物設(shè)計原則共設(shè)計了4對CyHV-2特異性引物，利用杭州眾測的RAA核酸擴增試劑盒對引物進行篩選。結(jié)果顯示，4對引物均能夠擴增出目的條帶，但引物CyHV-2-3-R、CyHV-2-3-F擴增的產(chǎn)物較單一且明亮（圖1），因此選擇其作為建立RAA-LDFD方法用的引物，并在上、下游引物的5’端分別標(biāo)記FITC和Biotin，以便用膠體金LFD檢測擴增產(chǎn)物。

圖1CyHV-2的RAA引物篩選

3.2 特異性試驗

分別以IHNV、SVCV、GV-9014的cDNA和CEV、KHV、EHNV、CCV的DNA為模板驗證已建立的檢測CyHV-2的RAA-LFD方法的特異性。結(jié)果顯示，僅CyHV-2的DNA模板出現(xiàn)正常擴增，在試紙條上同時出現(xiàn)檢測線和質(zhì)控線。陰性對照（DEPC處理水）及IHNV、SVCV、CEV、KHV等樣品均未出現(xiàn)擴增，僅出現(xiàn)質(zhì)控線（圖2）。由此可知，該方法能特異性擴增出CyHV-2中的靶序列，而不與其他病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。

圖2 檢測CyHV-2的RAA-LFD方法的特異性

3.3 靈敏度試驗

采用倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，比較RAALFD方法與常規(guī)PCR的敏感性。結(jié)果顯示，本實驗建立的RAA-LFD方法最低檢出限為8×100拷貝/μL（圖 3a），普通 PCR 的檢出限僅為 8×101拷貝/μL（圖3b），表明本研究建立的RAA-LFD方法敏感性高于普通PCR。

圖3 檢測CyHV-2的RAA-LFD方法的敏感性

3.4 臨床樣品檢測

利用所建立的RAA-LFD方法與PCR方法分別檢測疑似病例45份。檢測結(jié)果顯示RAA-LFD檢測出陽性樣品22份，陰性樣品23份；普通PCR檢測出陽性樣品20份，陰性樣品25份。2種方法的陽性符合率為95%，表明本研究建立的RAA-LFD方法可用于CyHV-2的現(xiàn)場檢測。

4 討論

皰疹病毒的特點之一是潛伏感染。在CyHV-2感染實驗的第151天后，日本學(xué)者用PCR方法在5尾表面健康實驗魚體內(nèi)檢測到4尾魚是CyHV-2陽性[16]。也有學(xué)者對18個漁場中的健康金魚進行定量PCR檢測，14個漁場的樣品是CyHV-2陽性[17]。潛伏感染給CyHV-2的確診帶來難度。盡早發(fā)現(xiàn)病毒感染，盡快采取積極的防控措施，是降低因CyHV-2感染發(fā)病而造成魚類死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是避免引入潛伏感染苗種的重要保障。

現(xiàn)有的魚類細胞對CyHV-2敏感性低，細胞培養(yǎng)方法在建立更加敏感而穩(wěn)定的細胞系后才能被廣泛使用[18]。目前，檢測 CyHV-2最普遍有效的方法是PCR擴增技術(shù)，包括普通PCR技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)、LAMP技術(shù)等。Waltzek等[19]基于CyHV-2的解旋酶基因建立了常規(guī)PCR，該方法具有較高的特異性和敏感性，針對構(gòu)建的質(zhì)粒和患病金魚腎脾組織DNA抽提液的分析靈敏度分別為78拷貝/μL和84 拷貝/μL，與普通 PCR 的檢出限（8×101拷貝/μL）一致。

RAA是一種借助于重組酶、聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白的新型等溫擴增技術(shù)。與其他DNA擴增技術(shù)相比，RAA不需要特殊設(shè)備即可在更短時間內(nèi)和較低溫度下將目的DNA擴增至可檢測水平。LFD是不需昂貴復(fù)雜儀器，可操作性高的可視化檢測工具。本研究聯(lián)合2種技術(shù)，按照RAA引物原則設(shè)計引物及探針，通過引物篩選、靈敏度和特異性實驗、臨床樣品檢測，建立了一種針對CyHV-2的RAA-LFD檢測方法。該檢測方法在37℃恒溫下反應(yīng)10 min，即可實現(xiàn)對CyHV-2目的基因片段的有效擴增，操作簡便，并與其他常見水生動物疫病病原核酸無交叉反應(yīng)；RAA擴增產(chǎn)物直接用LFD肉眼觀察，最低檢測限為8拷貝/μL，敏感性比普通PCR高10倍。對45份疑似病例進行檢測，2種方法符合率可達到95%，本研究建立的RAA-LFD方法可用于CyHV-2的現(xiàn)場檢測。