pH處理時間對刺參生長、攝食及消化酶活性的影響*

韓 莎，胡 煒，李成林**，曲洪霞，趙 斌，劉兆存

(1.山東省海洋生物研究院，山東青島 266104；2.乳山市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，山東乳山 264500；3.山東華春漁業(yè)有限公司 山東東營 257200)

0 引言

刺參ApostichopusjaponicusSelenka極高的營養(yǎng)價值和保健作用逐步得到世界的認(rèn)同，因此刺參也越來越受消費(fèi)者的喜愛。近年來，刺參增養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖方式多樣化，其中池塘養(yǎng)殖是目前我國刺參養(yǎng)殖的主要模式[1]。但是，池塘養(yǎng)殖易受水溫、鹽度等多種外界環(huán)境因素影響[2]，其中養(yǎng)殖水pH是關(guān)鍵因子之一[3-4]。與此同時，在池塘刺參養(yǎng)殖中還普遍存在底質(zhì)老化、池底糞便有害物質(zhì)大量積累與氨化分解等問題；另外，養(yǎng)殖池塘易受近岸海水的影響，尤其是近年來近海滸苔等大型藻類連續(xù)暴發(fā)[5]、腐爛，加之時常受到集中強(qiáng)降雨、酸雨、海水酸化等影響，池塘養(yǎng)殖水pH呈現(xiàn)周期性或臨時性波動，不同程度地影響著刺參攝食與生長。目前，有關(guān)養(yǎng)殖水pH對刺參生理影響的研究資料較少[6-7]，多集中在慢性脅迫對刺參影響的實(shí)驗(yàn)研究，而pH節(jié)律性變動對刺參生長和消化的影響相關(guān)研究尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)基于不同pH處理時間下刺參生長、攝食與消化酶活性的變化，以探明pH節(jié)律性變動與刺參生長、消化的關(guān)系，為刺參健康養(yǎng)殖和養(yǎng)殖水環(huán)境的調(diào)控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用刺參為青島國家海洋科研中心山東省海洋生物研究院鰲山基地選育的健康苗種，選取體表正常、活力強(qiáng)、攝食良好的苗種暫養(yǎng)在0.2 m3的玻璃鋼槽中，平均體重為(20.32±0.15) g。養(yǎng)殖海水為經(jīng)沉淀沙濾的自然海水，鹽度(31.4±0.2)‰，水溫14.6-17.3℃，溶解氧DO≥5.6 mg/L，24 h連續(xù)微量充氣，每天全量換水1次。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

實(shí)驗(yàn)刺參飼養(yǎng)在25 L的塑料整理箱中，每個箱中放置刺參10頭，每個實(shí)驗(yàn)組各設(shè)3個平行。以自然海水(pH=8.1±0.3)為對照，根據(jù)韓莎等[7]研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)定pH 7.3(A)、pH 8.9(B)兩個實(shí)驗(yàn)組，在這兩組pH條件下進(jìn)行5種處理，每日早上8:00通過換水調(diào)節(jié)在該pH條件下分別處理1 h (A1、B1)、3 h (A2、B2)、6 h (A3、B3)、9 h (A4、B4)、12 h(A5、B5)，再次換水使pH恢復(fù)正常，每天為1個實(shí)驗(yàn)周期。每日16:00投喂飼料l次，共持續(xù)30 d。各實(shí)驗(yàn)組使用1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水pH，在換水前調(diào)節(jié)校正至實(shí)驗(yàn)設(shè)計所需pH且穩(wěn)定后方可用于實(shí)驗(yàn)。采用哈納HI98185多參數(shù)水質(zhì)分析儀測定并及時校正水中pH，變化幅度為±0.05個單位。

1.2.2 刺參生長指標(biāo)測定

實(shí)驗(yàn)開始前1 d停止投喂，稱量刺參初始體重W0(g)，實(shí)驗(yàn)30 d結(jié)束前同樣停止投喂1 d后稱其體重最終值Wt(g)。稱重時，先將刺參取出，吸干體表水分后稱量。t為實(shí)驗(yàn)持續(xù)的時間(d)。觀測并記錄刺參吐臟、存活情況。N0為刺參實(shí)驗(yàn)個體數(shù)，Nt為刺參存活個體數(shù)，Ne為刺參排臟個體數(shù)，F(xiàn)為飼料總攝入量(g)。各項(xiàng)指標(biāo)統(tǒng)計、計算方法采用以下公式：

特定生長率(Specific Growth Rate，SGR，%)=(lnWt-lnW0)/t×100；

攝食率(Feeding Rate，F(xiàn)R，%)=2F/[t(Wt+W0)]×100;

食物轉(zhuǎn)化率(Food Conversion Ratio，F(xiàn)CR，%)=(Wt-W0)/F×100

1.2.3 刺參消化酶測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將刺參撈出待其排凈體內(nèi)海水，用滅菌紗布擦干體表水分放入玻璃培養(yǎng)皿中，沿腹部剪開，取出消化道，剔除呼吸樹，用超純水沖洗干凈，在-80℃超低溫冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)時取腸組織置于玻璃勻漿器中，加入10倍體積預(yù)冷的超純水，在冰浴條件下勻漿20 min，在高速冷凍離心機(jī)中(0-4℃，1 000 r/min)離心30 min，所得上清液置于冰箱保存待測。

消化酶指標(biāo)——蛋白酶和淀粉酶均采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定。蛋白酶活力測定采用鉬酸銨法，每毫克組織蛋白在37℃條件下每分鐘分解蛋白生成1 μg氨基酸相當(dāng)于1個酶活力單位(U)。淀粉酶(AMS)含量測定采用比濁法，組織中每毫克蛋白在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活力單位(U)。酶液中蛋白質(zhì)含量的測定按南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測定試劑盒上的說明進(jìn)行。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示，用SPSS 18.0及Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計，以P<0.05作為顯著性差異的標(biāo)志。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH處理時間對刺參生長和攝食的影響

如表1所示，A組刺參終末體重和SGR隨pH處理時間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，峰值出現(xiàn)在pH處理時間為6 h時，終末體重為 26.45 g，SGR為0.88%/d，除A2和A3組顯著高于對照組外(P<0.05)，其余各組與對照組無顯著差異(P>0.05)；當(dāng)pH處理時間超過6 h時，刺參終末體重和SGR逐漸下降且低于對照組，但差異不顯著。B組刺參終末體重和SGR隨pH處理時間的增加而逐漸下降，當(dāng)pH處理時間超過3 h時，刺參終末體重和SGR顯著低于對照組(P<0.05)，B5組刺參終末體重和SGR最低，分別為22.87 g、0.39%/d。

A組刺參FR、FCR隨pH處理時間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，除A2和A3組顯著高于對照組(P<0.05)，其余各組與對照組無顯著差異(P>0.05)，其中以A3組最高，F(xiàn)R為2.19%，F(xiàn)CR為39.85%，當(dāng)pH處理時間超過6 h時，刺參個體FR、FCR低于對照組，但差異不顯著；B組刺參FR、FCR隨pH處理時間的增加而逐漸下降，當(dāng)pH處理時間超過3 h時，刺參FR和FCR逐漸下降且顯著低于對照組(P<0.05)。

表1 不同pH處理時間對刺參生長和攝食的影響

Table 1 Effects of different pH treatment time on the growth and feeding ofA.japonicusSelenka

組別Group處理時間Time (h)初始體重Initial body weight (g)終末體重Final body weight (g)特定生長率Specific growth rate (%/d) 攝食率Feeding rate (%)食物轉(zhuǎn)化率Food conversion efficiency (%)對照CK020.32±0.15a24.56±0.17a0.63±0.06a1.75±0.06a36.08±0.20aA1120.32±0.15a25.32±0.13ab0.73±0.09ab1.89±0.11ab38.49±0.25abA2320.32±0.15a25.73±0.18b0.79±0.06b2.01±0.10b38.95±0.19bA3620.32±0.15a26.45±0.16b0.88±0.07b2.19±0.08b39.85±0.15bA4920.32±0.15a24.26±0.19a0.59±0.08a1.59±0.08a36.92±0.17aA51220.32±0.15a23.84±0.15a0.53±0.07a1.53±0.12a34.68±0.16aB1120.32±0.15a24.86±0.13a0.67±0.05a1.86±0.09a38.06±0.18aB2320.32±0.15a24.68±0.19a0.65±0.10a1.77±0.07a38.31±0.16aB3620.32±0.15a23.42±0.14c0.47±0.11c1.48±0.09c32.02±0.19cB4920.32±0.15a23.25±0.15c0.45±0.09c1.42±0.03c31.58±0.21cB51220.32±0.15a22.87±0.16c0.39±0.07c1.35±0.06c29.11±0.23c

注：同列中不同字母組間表示差異顯著(P<0.05)

Note:Values in the same column with different letter superscripts are significantly different (P<0.05)

2.2 pH處理時間對刺參消化酶活性的影響

2.2.1 pH處理時間對刺參蛋白酶活性的影響

由圖1可以看出，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，A組刺參蛋白酶活性隨著pH處理時間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。當(dāng)pH處理時間在1-6 h時，A組刺參蛋白酶活性隨著pH處理時間的增加逐漸升高，在處理時間6 h時達(dá)到最高，為7.75 U/mg prot，顯著高于對照組(P<0.05)，而其余各組與對照組差異不顯著。B組刺參蛋白酶活性隨著pH處理時間的增加呈現(xiàn)逐漸低于對照組的變化規(guī)律，以pH處理時間12 h時最低，為5.36 U/mg prot，各處理組與對照組差異不顯著(P>0.05)。

2.2.2 pH處理時間對刺參淀粉酶活性的影響

由圖2可以看出，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，A組刺參淀粉酶活性隨著pH處理時間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。當(dāng)pH處理時間在1-6 h時，A組刺參淀粉酶活性隨著pH處理時間的增加逐漸升高，在處理時間6 h時達(dá)到最高，為1.48 U/mg prot，顯著高于對照組(P<0.05)，而其余各組與對照組差異不顯著。B組刺參淀粉酶活性隨著pH處理時間的增加呈現(xiàn)逐漸低于對照組的變化規(guī)律，以pH處理時間12 h時最低，為1.79 U/mg prot，各處理組與對照組差異不顯著(P>0.05)。

圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Different letters on the graph mean siginificant differences (P<0.05)

圖1 不同pH處理時間對刺參蛋白酶活性的影響

Fig.1 Effect of different pH treatment time on protease activity ofA.japonicusSelenka

圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Different letters on the graph mean siginificant differences (P<0.05)

圖2 不同pH處理時間對刺參淀粉酶活性的影響

Fig.2 Effect of different duration pH treatment time on amylase activity ofA.japonicusSelenka

3 討論

3.1 pH處理時間對刺參生長的影響

研究表明，環(huán)境因子在適宜范圍內(nèi)變動，對水生生物的生長影響不大，但如果超過適宜范圍，就會產(chǎn)生抑制作用[8-9]。通常情況下，自然海水pH為7.8-8.5，水質(zhì)的變化時常會導(dǎo)致水體pH在4-10內(nèi)波動變化[6]。韓莎等[7]研究認(rèn)為通常情況下，當(dāng)養(yǎng)殖水pH為7.5-8.7時,刺參均可正?；顒印z食與生長，未表現(xiàn)出異常狀況。而本實(shí)驗(yàn)選擇的兩個pH梯度均超出該范圍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在養(yǎng)殖水pH為7.3時，隨著pH處理時間的增加，刺參SGR和攝食率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢；但相對于酸性方向的變化來說，堿性方向變化對刺參的抑制作用或產(chǎn)生的不利影響更為明顯。pH變化對刺參來說是一種應(yīng)激，筆者認(rèn)為應(yīng)激的效果取決于應(yīng)激的程度和時間，而不是單純產(chǎn)生不利的影響[10]。本實(shí)驗(yàn)中pH向酸性或者堿性方向的變化屬于小幅度應(yīng)激，每天不超過6 h的刺激，對刺參的應(yīng)激刺激尚處于喚醒階段隨即恢復(fù)正常，因此對刺參的攝食和生長有一定的積極作用，這一點(diǎn)與鄭振華等[11]對凡納濱對蝦的研究結(jié)果一致。而當(dāng)每日超過6 h的pH處理會使刺參進(jìn)入持續(xù)的應(yīng)激狀態(tài)，在抵御刺激中消耗大量的能量，因此用于生長的能量大幅度減少。隨著應(yīng)激時間的增加，刺參機(jī)體的代謝發(fā)生紊亂，SGR下降，從而影響刺參的攝食與生長。

3.2 pH處理時間對刺參消化酶活性的影響

水產(chǎn)動物的生長發(fā)育離不開對食物的消化吸收，而該過程的實(shí)現(xiàn)需要多種酶，尤其是消化酶。因此，消化酶活性的研究一直是水產(chǎn)動物消化生理的重要研究內(nèi)容[12]，眾多學(xué)者對消化酶的影響因素相繼開展大量的實(shí)驗(yàn)研究工作[13-15]，認(rèn)為溫度和pH是影響消化酶活力的最重要因素[16]。刺參作為棘皮動物，其體腔內(nèi)環(huán)境與水環(huán)境密切相關(guān)，水體pH的變化與刺參腸道消化酶活性密切相關(guān)，且直接影響著刺參消化酶活性的高低。

蛋白酶和淀粉酶是刺參腸道的主要消化酶。刺參能夠攝取沉積食物中的營養(yǎng)成分并合成自身的蛋白質(zhì)，主要靠蛋白酶發(fā)揮作用，其酶活力最高，其次是淀粉酶[17]。消化酶必須在一定的pH條件下才能表現(xiàn)出高活力[18]，消化酶活力的高低是刺參消化吸收能力的決定性因素[19]。付雪艷[20]認(rèn)為刺參蛋白酶活性最高時的水環(huán)境pH為7.0-9.0，而姜令緒等[19]認(rèn)為刺參中腸蛋白酶在pH為7.0-8.6時、淀粉酶在pH為6.6-7.4時其對應(yīng)的酶活性較高且相對穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在養(yǎng)殖水pH=7.3時，隨著pH處理時間的增加消化酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的變化，當(dāng)處理時間為6 h時，刺參蛋白酶和淀粉酶活力最高；而在養(yǎng)殖水pH=8.9時，蛋白酶和淀粉酶活性隨著pH處理時間的增加逐漸下降，該結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)水體pH在未超出蛋白酶和淀粉酶最適pH范圍時，消化酶活性的高低與pH處理時間關(guān)系密切。短時間的pH變動尚屬在刺參正常調(diào)節(jié)范圍內(nèi)，機(jī)體能夠創(chuàng)造出適合消化酶發(fā)揮活性的pH環(huán)境，有利于蛋白質(zhì)和淀粉的消化，因此在一定程度上提高食物轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)生長；而如果長時間處于pH變動的水環(huán)境中，刺參對飼料的攝食和消化利用受到影響，進(jìn)而不同程度地降低刺參的食物轉(zhuǎn)化率，導(dǎo)致生長減緩。

4 結(jié)論

水生生物生活在一個節(jié)律變動的環(huán)境下。pH作為應(yīng)激因子，對同一pH處理也會隨著不同處理時間的變化發(fā)生性質(zhì)上的改變，對水生生物產(chǎn)生有益或有害的作用效果。因此，在刺參養(yǎng)殖中，應(yīng)充分考慮養(yǎng)殖水體的pH變化幅度或者變化時間，盡量減少或者減緩pH變化的幅度和時間，從而減輕對刺參的應(yīng)激反應(yīng)，以保證刺參的充分?jǐn)z食和快速生長，提高養(yǎng)殖效率。