汽爆處理對鳙魚骨酶解特性的影響

董 燁 張益奇 姚洪正 何光喜 戴志遠

(1浙江工商大學海洋食品研究院，浙江 杭州 310035；2浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 杭州 310035； 3海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116000；4杭州千島湖發(fā)展集團有限公司，浙江 杭州 311701)

鳙魚(Aristichthys nobilis)俗稱胖頭魚，是我國主要淡水經(jīng)濟魚類，其繁殖速度快，產(chǎn)量大。 據(jù)統(tǒng)計，2018年我國鳙魚產(chǎn)量達309.6 萬t[1]。 鳙魚頭肥而味美，富含蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，深受消費者喜愛[2]。 但鳙魚頭的暢銷不可避免地導致魚骨、魚鱗、魚皮等下腳料亟待處理。 魚骨作為魚頭、魚片加工過程的主要副產(chǎn)物之一，其膠原蛋白及鈣含量豐富，而目前國內(nèi)對于魚骨的綜合利用技術比較滯后，大多只是被用作動物飼料或直接丟棄，利用率低，尋找合適的處理方法提高魚骨的利用價值，對我國水產(chǎn)品加工行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

目前，魚骨的處理方法主要有酸堿法[3-5]、酶解法[6-8]和高壓蒸煮法[9-11]等。 但酸堿法處理通常會對環(huán)境造成污染，而且在連續(xù)的加工步驟中操作困難，得率低、耗時長[12]，限制了魚骨的有效利用；酶解法雖然溫和可控，但魚骨內(nèi)部的膠原蛋白是由3 條螺旋鏈相互纏繞而成的螺旋結構，其基質(zhì)附著羥基磷灰石，使得魚骨非常堅固，難以被有效酶解[13]；高壓蒸煮法雖然可以提高酶解效率，但其所需時間較長，效率較低，而且可能導致一些熱敏性氨基酸損失[14]。 因此開發(fā)一種環(huán)境友好、簡便的魚骨預處理方法具有重要的研究意義。 近年來，汽爆技術[15]作為一種先進的物理化學預處理技術受到了廣泛的關注，其原理是將高壓蒸汽壓入物料內(nèi)部空隙，保壓一段時間后，瞬間泄壓，容器內(nèi)蒸汽通過膨脹對外做功，產(chǎn)生沖擊波對物料進行機械剪切，使得物料組分間緊密結構破壞、解離。 該技術相比于傳統(tǒng)的高壓蒸煮法具有短時、高效、能耗低的優(yōu)勢。

本試驗以鳙魚骨為研究對象，經(jīng)汽爆處理后，采用堿性蛋白酶酶解，以水解度、蛋白質(zhì)回收率、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)可溶性氮得率為指標，研究不同汽爆處理條件對鳙魚魚骨酶解特性的影響，進一步探究魚骨酶解產(chǎn)物分子量的分布情況，旨在建立一種簡單高效環(huán)保的預處理方法，為高效利用水產(chǎn)加工副產(chǎn)物提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳙魚魚骨，購自杭州千島湖；堿性蛋白酶Alcalase 3.0 T，丹麥諾維信公司中國天津分公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；碳酸酐酶(29 000 Da)、細胞色素C(12 400 Da)、抑肽酶(6 500 Da)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-histidyl-leucine，HHL)(429 Da)等，均購自美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設備

QBS 200B 汽爆機，正道生物能源公司；e2695 高效液相色譜，美國Waters 公司；400Y 多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；DGG-9123A 電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；K-360 凱氏定氮儀、K-425 快速消解儀，瑞士Buchi 公司；DSHZ-300A 旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚骨原料的前處理 將新鮮魚骨用清水沖洗后瀝干，用0.1 mol·L-1NaOH 溶液浸泡4 h，每2 h 換一次溶液，除去雜蛋白，流水沖至中性，瀝干備用。

1.3.2 汽爆處理工藝 將汽爆機預熱至所需壓力，取200 g 經(jīng)1.3.1 處理的魚骨置于汽爆機內(nèi)，保壓一定時間后瞬間泄壓，將樣品噴至接收器中，完全收集汽爆后的樣品于40℃烘干，粉碎后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 汽爆處理單因素及酶解試驗 保壓時間的影響:在汽爆壓力0.6 MPa、酶解溫度50℃、酶添加量2.0%、酶解時間3 h、初始pH 值8.0 條件下，設定保壓時間為0、0.5、1.0、2.0、3.0 min。

汽爆壓力的影響:在酶解溫度50℃、酶底比2.0%、酶解時間3 h、初始pH 值8.0，保壓時間3.0 min 條件下，設定汽爆壓力為0、0.3、0.6、1.0 MPa。

配制質(zhì)量分數(shù)6.0%的魚骨溶液，按酶底比1 ∶50加堿性蛋白酶，pH 值調(diào)至8.0 后，于恒溫振蕩水浴鍋中50℃恒溫酶解3.0 h。 將酶解液于沸水浴中滅酶10 min，8 000 r·min-1離心15 min，取上清液過濾備用。

1.3.4 水解度的測定 水解度采用甲醛滴定法[16]測定。

1.3.5 蛋白質(zhì)回收率的測定 采用BCA 試劑盒測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度，原料中的蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定。 按照公式計算蛋白質(zhì)回收率:

1.3.6 TCA 可溶性氮得率的測定 將20%TCA 與酶解液等體積比混合，然后于4℃靜置1 h，3 000×g離心10 min，采用BCA 試劑盒測定上清液可溶性蛋白含量。 按照公式計算TCA 可溶性氮得率:

1.3.7 酶解液分子量分布 參照涂丹等[17]的方法。色譜條件為:TSKgel G2000 SWxl(7.8 mm×300 mm，Tosoh)色譜柱，Waters e2695 HPLC 系統(tǒng)和UV/Vis 檢測器，檢測波長220 nm，流動相為乙腈45%-水溶液(0.1% TFA)55%，流速0.5 mL·min-1，進樣量10 μL，時間40 min。 相對分子質(zhì)量校正曲線所用標準品為:HHL(429 Da)、抑肽酶(6 500 Da)、細胞色素C(12 400 Da)、碳酸酐酶(29 000 Da)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行方差分析(ANOVA)，采用多重比較分析法對各組進行顯著性檢驗(P＜0.05)，用Origin Pro 2018 作圖。

2 結果與分析

2.1 汽爆處理對魚骨蛋白質(zhì)回收率的影響

由圖1 可知，蛋白質(zhì)回收率隨汽爆壓力和保壓時間的增加呈先增大后減小的趨勢，當汽爆壓力為0.6 MPa，保壓時間為2.0 min 時達到32.69%，而未處理組僅為7.92%，差異顯著(P＜0.05)，這可能是由于汽爆作用下蛋白質(zhì)結構疏展[18-19]，降解為更多小分子物質(zhì)，低分子物質(zhì)溶出，回收率增加。 而當保壓時間進一步延長，汽爆壓力進一步增大，蛋白質(zhì)回收率反而下降，這可能是由于當汽爆壓力過高，保壓時間過長，造成了可溶性蛋白的損失，魚骨蛋白過度水解，從而導致了回收率下降。

2.2 汽爆處理對TCA 可溶性氮得率的影響

TCA 可以沉淀十肽以上的蛋白質(zhì)[20]，采用TCA可溶性氮得率可表征酶解液的短肽得率。 由圖2 可知，當汽爆壓力為0.6 MPa，保壓時間為2.0 min 時TCA 可溶性氮得率為28.79%，較未處理組高出22.75%(P＜0.05)；維持保壓時間為3.0 min，當汽爆壓力進一步增大時，TCA 可溶性氮得率反而呈下降趨勢，但是仍較未處理組高出一倍，可見汽爆處理對于魚骨蛋白的提取具有顯著影響，這與蛋白質(zhì)回收率的趨勢一致。

2.3 汽爆處理對魚骨水解度的影響

圖1 汽爆處理對魚骨蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.1 Effect of steam explosion treatment on protein recovery of fish bone

圖2 汽爆處理對魚骨酶解液TCA 可溶性氮得率的影響Fig.2 Effect of steam explosion treatment on the soluble nitrogen in fish bone enzymatic hydrolysate

由圖3 可知，在保壓時間為3.0 min 條件下，魚骨水解度隨著汽爆壓力的增大逐漸增大(P＜0.05)，這可能是因為隨著汽爆壓力的增大，在高溫高壓的協(xié)同作用下，部分蛋白質(zhì)直接降解為小分子物質(zhì)，魚骨蛋白結構展開，三螺旋結構被破壞，暴露出更多酶切位點，蛋白質(zhì)肽鍵不斷斷裂，魚骨水解度逐漸增大。 在汽爆壓力為0.6 MPa 條件下，保壓時間為0.5～2.0 min 時，魚骨水解度隨保壓時間延長呈逐漸增大的趨勢，在保壓時間為2.0 min 時達到8.69%，而未處理組僅為3.45%，差異顯著(P＜0.05)，但隨著保壓時間的進一步延長其水解度變化不顯著(P＞0.05)。

2.4 魚骨酶解液相對分子質(zhì)量分布

以各標準品分子質(zhì)量的對數(shù)[lg(M)]為縱坐標，保留時間(t)為橫坐標作標準曲線。 由圖4 可知，lg(M)與t呈良好的線性關系，回歸方程為:lg(M)=-0.209t+6.992，決定系數(shù)R2=0.991 3。 根據(jù)回歸方程計算樣品相對分子質(zhì)量的分布情況。 圖5 為魚骨經(jīng)汽爆壓力0.6 MPa、保壓時間2.0 min 汽爆處理后的酶解液相對分子量分布情況。 結果表明，經(jīng)堿性蛋白酶酶解3.0 h 后基本不存在大分子，1 000 Da 以下的小分子占93%。 表明經(jīng)汽爆預處理后，鳙魚骨蛋白酶解較徹底，酶解效果較好。

3 討論

圖3 汽爆處理對魚骨水解度的影響Fig.3 Effect of steam explosion treatment on the degree of hydrolysis of fish bone

圖4 相對分子質(zhì)量標準曲線Fig.4 Standard curve of relative molecular mass

圖5 魚骨酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布色譜圖Fig.5 Chromatogram of relative molecular mass distribution of fish bone hydrolysate

近年來，酶法制備生物活性肽受到廣泛關注[21]。魚骨中蛋白分子通過氫鍵、疏水作用等次級鍵形成致密的纖維狀結構，使得酶催化位點被包埋，阻礙了蛋白酶水解。 此外，魚骨組分中灰分含量較高，主要以羥基磷灰石形式存在，這些抗性屏障使得魚骨難以被降解。研究發(fā)現(xiàn)，通過適當?shù)母邷馗邏禾幚砜梢云茐牡鞍踪|(zhì)分子的高級結構，使蛋白質(zhì)剛性結構軟化，處于解離狀態(tài)[22-23]，提高酶解效率。 如朱文慧等[24]采用超高壓耦合酶解技術處理鱈魚骨發(fā)現(xiàn)，超高壓酶解液中可溶性肽含量是常壓酶解液中的1.47 倍。 胡靜等[25]將金槍魚骨于121℃蒸煮30 min 后，采用響應面優(yōu)化酶解工藝，得到酶解產(chǎn)物水解度為12.34%。 吳克剛等[26]發(fā)現(xiàn)當蒸煮壓力為0.13 MPa、蒸煮時間為75 min 時，羅非魚骨的軟化效果最好。 高壓蒸煮處理在一定程度上有利于魚骨破碎，使蛋白分子結構發(fā)生改變，提高蛋白質(zhì)的溶出率，但用時相對較長。

汽爆技術作為一種綠色、高效的物理化學處理方法，已廣泛應用于生物質(zhì)原料的預處理，并取得了較好的效果。 汽爆技術整合了高溫高壓蒸煮產(chǎn)生的熱能以及瞬間泄壓產(chǎn)生的機械能，使得物料組分間緊密結構被破壞、解離，極大地縮短了預處理時間。 但將汽爆技術用于魚骨蛋白提取的研究仍鮮見報道。 本研究采用汽爆技術軟化魚骨，使魚骨部分蛋白質(zhì)溶出，蛋白質(zhì)結構疏展，更易于被酶切。 本研究表明，當汽爆壓力為0.6 MPa，保壓時間為2.0 min 時，TCA 可溶性氮得率和蛋白質(zhì)回收率分別是未處理組的4.76 倍和4.12倍，汽爆預處理可顯著提高魚骨蛋白的酶解特性。 相比于前人研究，本研究預處理時間更短，操作工藝更簡便，能耗更低，極大地提升了效率。 Tan 等[27]將鱈魚骨于121℃處理90 min，采用胰蛋白酶和風味蛋白酶進行酶解，得到2 種酶解產(chǎn)物中主要肽的分子量在1 000 ～3 000 Da 之間，1 000 Da 以下的肽分別占23.83%和29.63%。 Fan 等[28]將狹鱈骨架于121℃處理30 min，采用堿性蛋白酶酶解，得到酶解產(chǎn)物相對分子量在1 000 Da 以下的占29.34%。 本試驗所制得的鳙魚骨酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量在200 ～1 000 Da 之間的占93%，相比于前人研究，分子量較小，分布更集中。

本研究利用汽爆技術處理魚骨，在高溫蒸汽和機械剪切力作用下，一方面利于魚骨內(nèi)部蛋白質(zhì)從羥基磷灰石等抗性屏障溶出，另一方面適度熱處理可使蛋白質(zhì)結構展開，尤其是使膠原蛋白的三螺旋結構變得松散，暴露出更多酶切位點，更易于被酶切，有效釋放內(nèi)部活性肽段，在較短的酶解時間內(nèi)達到較好的酶解效果。 本試驗初步研究了汽爆處理對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響，但對魚骨汽爆處理最優(yōu)工藝參數(shù)，以及汽爆魚骨蛋白的構效關系還有待進一步研究。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)汽爆處理能顯著提高魚骨蛋白溶出率和降解程度。 當汽爆壓力為0.6 MPa，保壓時間為2.0 min 時，蛋白質(zhì)回收率為32.69%，TCA 可溶性氮得率為28.79%，是未處理組的4～5 倍，此時魚骨水解度為8.69%，酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量主要分布在1 000 Da以下，高達93%。 本研究只針對汽爆處理對魚骨酶解特性進行了初步探究，后續(xù)可從產(chǎn)業(yè)需求出發(fā)，有針對性地開發(fā)具有抗氧化性、抗凍性、抗菌性等功能特性的魚骨水解液，進一步拓寬魚骨蛋白資源用途。 汽爆作為一種物理化學預處理技術，具有綠色環(huán)保、短時高效等優(yōu)勢，為水產(chǎn)加工副產(chǎn)物中豐富的蛋白質(zhì)資源開發(fā)利用提供了一條新途徑。