費菜黃酮對柑橘意大利青霉菌抑制作用的研究

羅 潔 王鴻飛 許 鳳 王 靖 池宗豫 謝柯沁 吳承豪 邵興鋒

(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315211)

柑橘(Citrus reticulataBlanco) 為柑橘亞科(subfamily Aurantioideae)柑橘屬(CitrusL.)植物，其果實營養(yǎng)豐富，兼具藥用價值。 柑橘果實在采后貯運期，由意大利青霉菌(Penicillium italicum)引起的采后青霉病較為常見，且在冷藏條件下更具危害性，可直接侵染健康果實[1]，導(dǎo)致果實產(chǎn)量和品質(zhì)迅速下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[2-3]。 目前，控制柑橘采后病害主要采用化學(xué)殺菌劑，如咪鮮胺、苯基苯酚、抑霉唑等，在柑橘上得到了廣泛應(yīng)用，然而殺菌劑殘留物會對人體健康以及環(huán)境構(gòu)成潛在的風(fēng)險。 費菜(Sedum aizoonL.)為景天科(crassulaceae)多年生野生草本植物，富含黃酮、多酚、多糖等功效成分[4]，具有抑菌活性，其作為植物源抑菌劑在天然保鮮防腐劑開發(fā)方面前景廣闊。

黃酮(flavonoids)是一類通常由2 個具酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連接而成的低分子量植物次生代謝產(chǎn)物[5]。 大量研究表明黃酮類化合物通過影響細(xì)胞膜功能發(fā)揮抑菌機制[6]。 Peralta 等[7]發(fā)現(xiàn)高濃度(200～1 000 μmol·L-1)異戊二烯類黃酮[2′，4′-dihydroxy-5′-( 1?，1?-dimethylallyl ) 8-prenylpino cembrin，8PP]處理的生物膜表現(xiàn)出不同的擴散距離，改變了其表面結(jié)構(gòu)、空隙、通道和孔隙，進而影響了生物膜基質(zhì)內(nèi)部的流動性。 Tsuchiya 等[8]研究表明，槐屬二氫黃G( 5，7，2′，4′-tetrahydroxy-8-lavandulylflavanone，sophoraflavanone G)主要通過降低細(xì)胞膜的流動性，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)如酶、蛋白質(zhì)、離子和核苷酸等成分的泄漏。 此外，也有植物源黃酮作用于菌體細(xì)胞膜達到抑菌效果的相關(guān)報道，如高良姜可以通過損傷金黃色葡萄球菌細(xì)胞質(zhì)膜，致使其鉀離子滲漏，造成細(xì)胞壁的滲透溶解或菌體的自我分解；蜂膠中的槲皮素可以增加細(xì)菌內(nèi)膜的通透性，致使膜電位發(fā)生改變，從而增強其抑菌活性[9]。

前期研究表明，費菜黃酮通過膜損傷機制對豬肉腐敗菌乳酸菌發(fā)揮抑菌作用[10]，對食源性致病菌大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等均具有抑制效果[11]。 費菜黃酮對柑橘類水果致病菌的抑菌作用尚未見報道，本研究從體外和體內(nèi)兩方面探討費菜黃酮對意大利青霉的抑制作用及其機制，以期為柑橘的防腐保鮮提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

費菜采自寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程實驗基地，自然晾曬，60℃烘至水分含量小于5%后粉碎，過80 目篩，得費菜干粉；柑橘于2018年10-11月期間采摘自寧波市秋歌生態(tài)農(nóng)場橘園，挑選大小均勻、色澤統(tǒng)一、成熟度一致、無機械損傷、無病蟲害果實，立即運回實驗室；意大利青霉(P. italicum)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所提供，4℃馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體(potatodextrose agar，PDA)培養(yǎng)基斜面保存。

PDA 培養(yǎng)基、馬鈴薯肉湯(potato dextrose broth，PDB)培養(yǎng)基，均購于杭州微生物試劑有限公司；H2O2測定試劑盒(比色法)，南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國藥分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DNP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；B204LEDR 生物顯微鏡，重慶光學(xué)分析儀器廠；Biofugestratos 臺式高速冷凍離心機，德國Thermo Scienific SORVALL 公司；Cary50Scan 紫外分光光度計，美國瓦里安技術(shù)中國有限公司；S-3400N 型掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 費菜黃酮的制備與測定 采用乙醇超聲波輔助提取法[12]。 取適量費菜干粉，用90%乙醇按1 ∶40(w ∶v)料液比混合，超聲波輔助提取50 min(功率400 W，溫度60℃)，之后60℃水浴浸提2 h，室溫抽濾，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后加入2 倍體積無水乙醇于4℃靜置過夜，除去多糖；經(jīng)AB-8 大孔樹脂純化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后于-40℃冷凍干燥72 h 制成粉末；取適量粉末用30%乙醇溶解，采用AlCl3比色法測定總黃酮含量。

1.3.2 孢子懸浮液的制備 將意大利青霉接種至PDA 培養(yǎng)基上，于28±1℃培養(yǎng)7 d 進行活化。 用無菌生理鹽水(0.9%)沖洗平板洗下孢子，8 層無菌紗布過濾去除營養(yǎng)菌絲體，收集孢子懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整濃度約為106spores·mL-1。

1.3.3 最低抑菌濃度 ( minimum inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度( minimum fungicidal concentration，MFC)的測定 采取倍半稀釋法[13]制成費菜黃酮終濃度為0.22、0.44、0.87、1.75、3.50、7.00、14.00 和28.00 mg·mL-1的含藥PDA 平板，以不含費菜黃酮的平板為空白對照，接種20 μL 濃度約為106spores·mL-1的孢子懸浮液，均勻涂布。 28±1℃恒溫培養(yǎng)48 h 后觀察，以完全沒有菌絲生長的最低濃度作為MIC；測出MIC 后，將MIC 下的PDA 平板繼續(xù)于28℃培養(yǎng)7 d，觀察菌絲的生長情況，以無菌絲生長的濃度作為MFC。

1.3.4 費菜黃酮對意大利青霉的抑菌活性 參考Wang 等[14]的方法，將濃度分別為0、0.87、1.75、3.50、7.00 mg·mL-1的費菜黃酮與103spores·mL-1孢子懸浮液混合，于28±1℃培養(yǎng)16 h 后，將費菜黃酮和孢子的混合物倒入PDA 平板涂布均勻，培養(yǎng)72 h 后計菌落數(shù)，按照公式計算分子孢子存活率:

1.3.5 費菜黃酮對意大利青霉菌絲生長的抑制作用 采用瓊脂稀釋培養(yǎng)法[15]，將費菜黃酮加至PDA 培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為0.44、0.87、1.75、3.50、7.00、14.00 和28.00 mg·mL-1，以不加費菜黃酮作為空白對照。 取1 mL 106spores·mL-1孢子懸浮液至PDA 培養(yǎng)基上，涂布均勻后于28±1℃培養(yǎng)5 d，以備制作菌餅，打孔器打取菌餅(6 mm×6 mm)后反貼至含藥平板中央，于28±1℃培養(yǎng)。 采用十字交叉法測量菌落直徑，并根據(jù)公式計算抑菌率:

1.3.6 細(xì)胞膜通透性的測定 參考Yang 等[16]的方法，將濃度為106spores·mL-1孢子懸浮液接種于PDB培養(yǎng)基中，于28℃、135 r·min-1恒溫回轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)48 h，稱取1 g(濕重)菌絲加入費菜黃酮使其終濃度為1 MIC，對照加入等量無菌水。 于培養(yǎng)后0、3、6、9、12 h分別取樣測定胞外電導(dǎo)率P1，無菌絲體的離子導(dǎo)電性為電導(dǎo)率本底值P0；菌絲煮沸10 min 冷卻后測定總電導(dǎo)率Pk。 按照公式計算相對電導(dǎo)率:

式中，P1為菌絲胞外電導(dǎo)率；Pk為總電導(dǎo)率；P0為電導(dǎo)率本底值。

1.3.7 細(xì)胞成分釋放的測定 將濃度為106spores·mL-1的意大利青霉孢子懸浮液加入PDB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h 后加入費菜黃酮，使其終濃度為1 MIC，對照組加入等量無菌水，于28℃、135 r·min-1搖培，12 000 r·min-1離心收集上清液。 采用蒽酮法[17-18]測定菌懸液的總糖含量。

1.3.8 菌絲丙二醛(malondialdehyde，MDA)和H2O2含量的測定 菌絲培養(yǎng)及處理方法如1.3.6，收集處理后的菌絲，使用H2O2試劑盒測定菌絲H2O2含量。 參考Xu 等[19]的方法測定菌絲MDA 含量，計算公式如下:

式中，Vt為提取液總體積，mL；Vs為測定用提取液體積，mL；W 為樣品重量，g。

1.3.9 意大利青霉菌絲表面形態(tài)的觀察 從生長7 d的菌落中洗脫孢子懸液，接種至50 mL 液體培養(yǎng)基中，于28±1℃，120 r·min-1搖培2 d。 然后參考Wallace等[20]的方法，分別經(jīng)1 MIC 和1 MFC 費菜黃酮處理12 h，以正常生長的菌絲作為對照。 收集菌絲球，置于3.0%戊二醛中4℃、pH 值7.2 條件下固定過夜，經(jīng)0.1 mol·L-1磷酸 鹽緩沖 液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗、乙醇梯度脫水、叔丁醇置換，冷凍干燥、粘樣、噴金后，于掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)下觀察并拍照。

1.3.10 發(fā)病率和病斑直徑的測定 果實用清水清洗干凈、晾干，用75%乙醇擦拭果皮，自然晾干。 用無菌槍頭在果實赤道部位形成大小統(tǒng)一的傷口(直徑3 mm，深度4 mm)，并注入20 μL 濃度分別為0(對照組)、0.3、0.6、1.2 mg·mL-1的費菜黃酮，自然晾干后于傷口處接種104spores·mL-1孢子懸浮液10 μL，待其晾干后放入塑料保鮮盒中。 于25±1℃、相對濕度85%條件下培養(yǎng)5 d，發(fā)病后每隔1 d 測量柑橘果實的病斑直徑，統(tǒng)計果實的發(fā)病率。 每個處理27 個果實，重復(fù)2次。 采用十字交叉法測定果實病斑直徑，取平均值；果實病斑直徑≥0.50 cm 確定為發(fā)病。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SAS 8.1 軟件的Duncan′s multiple-range test進行多重比較，采用Origin 9.0 對數(shù)據(jù)進行處理分析并制圖。 未經(jīng)說明，試驗重復(fù)3 次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度和最小殺菌濃度的確定

由表1 可知，費菜黃酮對意大利青霉有較好的抑制作用，培養(yǎng)2 d 時，當(dāng)費菜黃酮濃度≥1.75 mg·mL-1時；未見明顯的菌落生長，說明費菜黃酮對意大利青霉的MIC 為1.75 mg·mL-1；而培養(yǎng)7 d 時，當(dāng)費菜黃酮濃度≥7.00 mg·mL-1時，未見明顯菌落，說明費菜黃酮對意大利青霉的MFC 為7.00 mg·mL-1。

表1 費菜黃酮對意大利青霉的MIC 和MFCTable 1 The MIC and MFC of flavonoids from Sedum aizoon L. on P. italicum

2.2 費菜黃酮對意大利青霉的抑菌活性

由圖1 可知，費菜黃酮對意大利青霉有較好的抑制效果，當(dāng)費菜黃酮濃度為0.87、1.75、3.50、7.00 mg·mL-1時，意大利青霉菌的存活率均顯著低于對照組(P＜0.05)；當(dāng)費菜黃酮濃度達到7.00 mg·mL-1，意大利青霉的可見菌落百分比為0。

2.3 費菜黃酮對意大利青霉菌絲生長的影響

費菜黃酮對意大利青霉的體外抑菌效果如表2 所示，隨著費菜黃酮濃度的增加，抑菌效果也隨之增強，呈較好的劑量效應(yīng)關(guān)系；當(dāng)費菜黃酮濃度為0.44 mg·mL-1時，菌絲生長抑制率達到60.53%，當(dāng)費菜黃酮濃度達到3.50 mg·mL-1時，抑菌率增加至84.91%。培養(yǎng)2 d 時，當(dāng)費菜黃酮含量大于1.75 mg·mL-1時，菌絲基本未生長，也說明了費菜黃酮的最小抑菌濃度為1.75 mg·mL-1；培養(yǎng)4 d 時，7.00 mg·mL-1費菜黃酮能完全抑制意大利青霉菌絲體生長，且費菜黃酮濃度介于0.44～3.50 mg·mL-1時也對意大利青霉菌有不同程度的抑制作用。

2.4 費菜黃酮對意大利青霉細(xì)胞膜通透性的影響

由圖2 可知，經(jīng)1.75 mg·mL-1(1 MIC)費菜黃酮處理后，意大利青霉菌懸液相對電導(dǎo)率隨處理時間的延長總體呈上升趨勢；處理9 h 時，費菜黃酮處理組的相對電導(dǎo)率為19.58%，顯著高于對照組(4.61%)(P＜0.05)；當(dāng)處理時間延長至12 h 時，處理組的相對電導(dǎo)率升高至45.37%，顯著高于對照組(14.43%)。 表明菌體細(xì)胞膜的通透性增加，離子穩(wěn)態(tài)遭到一定的破壞。

表2 不同費菜黃酮濃度對意大利青霉菌絲生長的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of different flavonoids concentrations against mycelial growth of P. italicum

圖1 費菜黃酮對意大利青霉分生孢子存活率的影響Fig.1 Effects of flavonoids from Sedum aizoon L.on conidia viability of the P. italicum in vitro

圖2 費菜黃酮對意大利青霉菌細(xì)胞膜通透性的影響Fig.2 Effect of flavonoids from Sedum aizoon L.on permeability of the P. italicum cell membrane

2.5 費菜黃酮對意大利青霉細(xì)胞成分釋放的影響

由圖3 可知，隨著費萊黃酮處理時間的延長，對照組菌懸液總糖含量總體呈下降趨勢，1.75 mg·mL-1(1 MIC)費菜黃酮處理組菌懸液總糖含量總體呈上升趨勢，處理3 h 時，處理組菌懸液總糖含量為54.43 mg·mL-1，顯著高于對照組(48.01 mg·mL-1)，處理時間延長至12 h 時，處理組菌懸液總糖含量達到58.63 mg·mL-1，仍顯著高于對照組。 表明經(jīng)費菜黃酮處理后菌體胞內(nèi)糖類物質(zhì)泄露出胞外。

圖3 費菜總黃酮對意大利青霉菌細(xì)胞胞外總糖含量的影響Fig.3 Effects of flavonoids from Sedum aizoon L. on total sugars of P. italicum

2.6 費菜黃酮對意大利青霉菌MDA 和H2O2 含量的影響

由圖4-A 可知，隨著費菜黃酮處理時間的延長，意大利青霉菌MDA 含量總體呈上升趨勢，以3 ～9 h內(nèi)變化最為明顯，在處理3 h 時菌絲MDA 含量達到4.06 mmol·g-1，顯著高于對照組(2.24 mmol·g-1)(P＜0.05)，處理9 h 時MDA 含量增至5.66 mmol·g-1，當(dāng)處理時間為12 h 時，意大利青霉菌絲MDA 含量有所降低，但仍顯著高于對照組(2.04 mmol·g-1)(P＜0.05)。 由圖4-B 可知，經(jīng)費菜黃酮處理后意大利青霉菌絲H2O2含量顯著升高(P＜0.05)，處理3 h 時H2O2含量達到25.73 mmol·g-1，處理時間延長至6 h時，意大利青霉菌絲H2O2含量上升至33.77 mmol·g-1，隨后H2O2含量基本穩(wěn)定。 表明費萊黃酮處理后菌體受到氧化脅迫，暗示細(xì)胞膜受到了損傷。

圖4 費菜黃酮對意大利青霉菌MDA(A)和H2O2(B)含量的影響Fig.4 Effect of flavonoids from Sedum aizoon L. on MDA (A) and H2O2(B) contents of P. italicum cells

2.7 費菜黃酮對意大利青霉菌絲形態(tài)的影響

處理前的意大利青霉菌絲呈現(xiàn)出正常和完整的管狀結(jié)構(gòu)，并且菌絲表面平滑(圖5-A)。 而經(jīng)MIC(1.75 mg·mL-1)和MFC(7.00 mg·mL-1)黃酮處理后的菌絲發(fā)生了明顯變化，MIC 處理的菌絲局部失水凹陷，表面粗糙，出現(xiàn)褶皺(圖5-B)；MFC 黃酮處理菌絲的損傷比MIC 更為嚴(yán)重，菌絲結(jié)構(gòu)完全破壞，嚴(yán)重塌陷，同時出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)的流失(圖5-C)。

2.8 費菜黃酮對損傷接種意大利青霉的柑橘發(fā)病率及病斑直徑的影響

如圖6-A 所示，費菜黃酮能抑制柑橘采后青霉病病菌的生長，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，即隨著費菜黃酮濃度的升高，柑橘果實病斑直徑變小。 由圖6-B 可知，接種意大利青霉后第2 天，1.2 mg·mL-1費菜黃酮處理組柑橘采后青霉發(fā)病率為25.92%，顯著低于對照組(P＜0.05)；接種3 d，0.6、1.2 mg·mL-1費菜黃酮處理組的果實發(fā)病率分別為85.19%和81.48%，均顯著低于對照組(P＜0.05)；接種4 d，處理組和對照組發(fā)病率均達到100%，無顯著差異，說明費菜黃酮可能作用于發(fā)病前期。 由圖6-C 可知，接種意大利青霉后的第2天，1.2 mg·mL-1費菜黃酮處理組果實病斑直徑在0.64 cm 以內(nèi)，0.3、0.6 mg·mL-1費菜黃酮處理組與對照組之間差異不顯著(P＞0.05)；接種后第3 天，病斑直徑迅速增大，各費菜黃酮處理組果實病斑直徑與對照組均無顯著差異(P＞0.05)；接菌后第4 天，對照組果實病斑直徑達到2.94 cm，顯著高于0.6 mg·mL-1處理組(2.57 cm)及1.2 mg·mL-1處理組(2.62 cm)(P＜0.05)；接種后第5 天，病斑直徑隨著費菜黃酮濃度的升高總體呈減小趨勢，各處理組間無顯著性差異(P＞0.05)，但均顯著小于對照組(P＜0.05)。

圖5 費菜黃酮對意大利青霉菌絲處理后掃描電子顯微鏡觀察Fig.5 Scanning electron microscope observation of P. italicum mycelia after flavonoids treatment

3 討論

細(xì)胞膜是細(xì)胞選擇性滲透屏障，一旦受到損傷，胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)會失衡，造成不可逆的損傷，進而導(dǎo)致菌體細(xì)胞的死亡[21-22]。 通過測定細(xì)胞膜通透性發(fā)現(xiàn)，費菜黃酮同樣作用于菌體細(xì)胞膜，打破菌體的保護屏障，進而引起胞內(nèi)物質(zhì)泄露，導(dǎo)致相對電導(dǎo)率上升，這與馮亞凈等[23]、Paul 等[24]和李珊珊等[25]的結(jié)果相似。 糖類是細(xì)胞內(nèi)重要的能量儲備物質(zhì)，本研究發(fā)現(xiàn)對照組菌懸液中糖類物質(zhì)被意大利青霉利用而減少，處理組菌懸液中總糖含量增加，表明費菜黃酮可能作用于意大利青霉細(xì)胞膜，導(dǎo)致胞內(nèi)糖類成分釋放，進而說明細(xì)胞膜損傷后胞內(nèi)功能物質(zhì)大量流失。 此外，本試驗結(jié)果顯示，經(jīng)費菜黃酮處理后意大利青霉菌MDA 和H2O2含量升高，在一定程度上反映了活性氧的爆發(fā)，側(cè)面說明意大利青霉發(fā)生了氧化損傷[26]。 掃描電鏡結(jié)果顯示，處理組菌絲結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，菌絲表面出現(xiàn)褶皺、塌陷，菌體細(xì)胞質(zhì)流失，表明細(xì)胞膜損傷進而使得意大利青霉胞內(nèi)成分釋放，說明費菜黃酮對意大利青霉形態(tài)功能有影響。

黃酮類物質(zhì)具有廣譜的抑菌特性，對細(xì)菌、真菌等均具較高的抑制活性，作用于菌體使其能量代謝受到影響、破壞細(xì)胞膜的完整性、抑制核酸以及蛋白的合成表達均已被證實[27-28]。 前期研究發(fā)現(xiàn)費菜黃酮對冷卻豬肉腐敗菌具有較好的抑制效果[29]，通過破壞細(xì)胞膜完整性，造成菌體內(nèi)環(huán)境紊亂，抑制高分子蛋白質(zhì)的表達和積累，達到抑菌和殺菌的作用。 本試驗所用費菜黃酮經(jīng)純化凍干其純度為45.67%，主要含有槲皮素、槲皮苷、山奈酚等[30]，費菜黃酮對柑橘腐敗菌意大利青霉表現(xiàn)出較好的抑菌活性，MIC 為1.75 mg·mL-1，初步探索黃酮成分可能通過破壞菌體細(xì)胞膜，進而導(dǎo)致功能性成分的釋放，達到殺菌效果，但具體是單一黃酮作用還是多種黃酮協(xié)同作用仍需進一步研究。

柑橘果實在采后貯藏階段易受意大利青霉的侵染，采后果實青霉病的控制成為柑橘病害的研究熱點。目前，諸多研究通過抑制菌絲生長控制了柑橘采后青霉病，Wang 等[14]發(fā)現(xiàn)肽PAF56 具較高的抑菌活性，能較好地控制柑橘采后青霉病的發(fā)生。 Tao 等[31]利用椪柑精油對意大利青霉進行處理，發(fā)現(xiàn)椪柑精油中活性成分可抑制菌絲的生長。 本研究發(fā)現(xiàn)，費菜黃酮可抑制意大利青霉菌絲的生長，且具劑量依賴效應(yīng)，用費菜黃酮處理后可延緩柑橘果實的發(fā)病進程。 不同抑菌方法對柑橘青霉病在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出抑制效果，可能在體外抑菌測試中直接作用于病原菌導(dǎo)致其死亡，運用于柑橘果實，可抑制病原菌生長，從而降低發(fā)病率，減輕病菌對果實的侵害。 費菜黃酮單一處理仍具有局限性，下一步研究可嘗試將費菜黃酮與其他抑菌活性物質(zhì)復(fù)合應(yīng)用于柑橘保鮮。

4 結(jié)論

費菜黃酮可以明顯抑制意大利青霉的生長，通過破壞意大利青霉細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)功能性物質(zhì)滲透到胞外，菌體發(fā)生氧化損傷，達到抑菌殺菌的效果。 采用費菜黃酮處理柑橘果實，可降低果實的發(fā)病率，減小病斑直徑。 但費菜黃酮抑菌的機制仍需進一步深入探究。