穩(wěn)定表達(dá)敲入增強(qiáng)綠色熒光蛋白標(biāo)記的干擾素 γ受體2基因Ifngr2的黑素瘤細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定

樊 浩，周 濤，李衛(wèi)華

（國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850）

腫瘤的免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療以其顯著的療效日益受到人們的重視。目前臨床已經(jīng)批準(zhǔn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）、程序性死亡受體蛋白 1（programmed cell death protein 1，PD-1）及細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）的抗體用于治療晚期黑素瘤、小細(xì)胞肺癌和轉(zhuǎn)移性膀胱癌等一系列癌癥。然而免疫檢查點(diǎn)抑制劑僅對(duì)約20%的患者有效，導(dǎo)致治療失敗的原因和機(jī)制還未被充分闡明。干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）信號(hào)通路在免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。一方面，IFN-γ可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤血管的生成發(fā)揮直接抗腫瘤作用；另一方面，IFN-γ可以調(diào)節(jié)腫瘤的轉(zhuǎn)移方式和免疫系統(tǒng)的功能間接抑制腫瘤的生長(zhǎng)。近期大量研究表明，IFN-γ信號(hào)通路的功能狀態(tài)決定了免疫檢查點(diǎn)治療的成敗[1-3]。

IFN-γ通過(guò)與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，并調(diào)控干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)[4]。IFN-γ受體（IFN-γ receptor，IFN-γR）包含2種不同亞基，分別是IFN-γ受體1（IFN-γ receptor 1，IFNGR1）和IFNGR2[5-7]。研究表明，細(xì)胞表面IFNGR1的表達(dá)是過(guò)量的，發(fā)揮著結(jié)合IFN-γ的作用[8]；而IFNGR2的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，其表達(dá)量決定了細(xì)胞對(duì)IFN-γ信號(hào)的反應(yīng)性[9]。明確IFNGR2的表達(dá)調(diào)控機(jī)制有助于闡明IFN-γ信號(hào)通路的調(diào)控方式和機(jī)制，從而為提高腫瘤的免疫治療效果提供新的策略。

CRISPR-Cas9介導(dǎo)的微同源末端連接敲入技術(shù)（microhomology-mediated end-joining）是一種新型的基因編輯技術(shù)，利用CRISPR-Cas9造成基因組指定位點(diǎn)的DNA雙鏈斷裂，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的微同源重組修復(fù)機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)基因編輯，所需同源序列長(zhǎng)度僅約為25 bp，具有載體構(gòu)建簡(jiǎn)單，物種應(yīng)用性廣泛，編輯效率高等優(yōu)勢(shì)[10]。本研究利用CRISPRCas9介導(dǎo)的微同源末端連接敲入技術(shù)將增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因序列敲入到細(xì)胞內(nèi)Ifngr2基因的最后一個(gè)外顯子末端，使其和Ifngr2基因融合表達(dá)，將最新的基因編輯技術(shù)應(yīng)用于IFNGR2表達(dá)調(diào)控研究，為發(fā)現(xiàn)IFNGR2的表達(dá)調(diào)控因子和靶向腫瘤免疫的藥物篩選提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

B16黑素瘤細(xì)胞（美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所）。pX330A-1x2，pX330S-2-PITCh 及pCRIS-PITCh（v2）-FBL質(zhì)粒（美國(guó)Addgene質(zhì)粒共享信息庫(kù)），BbsI和BsaI核酸內(nèi)切酶（美國(guó)NEB公司），Taq Mix以及T4連接酶（美國(guó)Thermo公司），DH5α菌株和6×核酸電泳上樣緩沖液（北京博邁德技術(shù)有限公司），DNA電泳Marker BM2000和 BM15000，Gen-Green核酸染料（北京博邁德基因技術(shù)有限公司），小提質(zhì)粒試劑盒及中提質(zhì)粒試劑盒和膠回收試劑盒（美國(guó)Promega公司），1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），胰酶和青、鏈霉素雙抗（邁晨科技有限公司），質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTMLTX（美國(guó)Invitrogen公司），嘌呤霉素（美國(guó)Amresco公司），基因組提取試劑盒（康為世紀(jì)公司），質(zhì)粒測(cè)序服務(wù)（生工生物工程有限公司）。冷凍離心機(jī)5418R以及微量移液器Research?plus系列（美國(guó)Eppendorf公司），PCR儀器T100（美國(guó)Bio-Rad公司），恒溫培養(yǎng)箱3951（美國(guó)Thermo公司），超低溫冰箱BCD-471WDEA（海爾公司），流式細(xì)胞儀FACSCanto Ⅱ（美國(guó)BD公司）。

1.2 小引導(dǎo)RNA靶點(diǎn)選擇及其寡核苷酸鏈合成

應(yīng)用http：//chopchop.cbu.uib.no/網(wǎng)站設(shè)計(jì)Ifngr2小引導(dǎo)RNA（small guide RNA，sgRNA）。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了2個(gè)位點(diǎn)，分別命名為PAM1和PAM2。引物序列如表1所示，引物名稱(chēng)分別為Ifngr2-sgRNA-PAM1和Ifngr2-sgRNA-PAM2，由生工生物工程有限公司合成。設(shè)計(jì)思路及實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。

Tab.1 Prime sequences of small guide RNA（sgRNA）

Fig.1 Schematic illustration of CRlSPR/Cas9-mediated Ifngr2-enhanced green fluorescent protein （EGFP）knock-in.A：the target site at the 7thexon close to the stop codon and the donor vector contains a EGFP cDNA for C-terminal fusion；B：general work flow of CRIS-PITCh mediated gene knock-in in B16 cells.

1.3 CRlSPR-Cas9 載體和CRlS-PlTCh（v2）載體構(gòu)建

構(gòu)建CRISPR-Cas9載體，首先將sgRNA引物退火形成DNA雙鏈。BbsI酶切pX330A-1x2后進(jìn)行膠回收。退火引物和酶切載體按比例混合，置緩沖體系，采用T4 DNA連接酶連接。隨后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化涂板，挑選單克隆后進(jìn)行菌液鑒定及測(cè)序分析。選取序列正確的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取pX330-1x2-sgRNA質(zhì)粒。進(jìn)一步，采用BsaⅠ酶切pX330A-1x2-sgRNA和pX330S-2-PITCh，酶切產(chǎn)物回收純化后，使用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化涂板，然后挑選單克隆進(jìn)行菌液鑒定及測(cè)序比對(duì)分析，提取序列正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，備用。

構(gòu)建CRIS-PITCh（v2）載體，選定擬敲入EGFP的位置，設(shè)計(jì)并合成引物（表2），對(duì)目的片段和載體分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后片段采用瓊脂糖凝膠電泳分離并純化。將插入片段和載體用重組酶進(jìn)行同源重組后，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化涂板，挑取單克隆并進(jìn)行菌液鑒定以及測(cè)序比對(duì)分析，提取序列正確的克隆質(zhì)粒，備用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

B16細(xì)胞使用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，胰酶消化B16細(xì)胞并傳代至6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時(shí)，根據(jù)LTX轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。設(shè)置pmcherry-C1質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，將CRISPR-Cas9 載體和 CRIS-PITCh（v2）載體與LTX按比例混勻后靜置15 min，然后逐滴加入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6 h后吸除培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下觀察陽(yáng)性對(duì)照組熒光情況，以確認(rèn)轉(zhuǎn)染效果。

1.5 單克隆篩選及EGFP敲入Ifngr2基因細(xì)胞系的鑒定

轉(zhuǎn)染72 h后將細(xì)胞由6孔板轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基替換為含有嘌呤霉素（2 g·L-1）的培養(yǎng)基，每3 d更換1次培養(yǎng)液，直至培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出單克隆細(xì)胞團(tuán)。將單克隆細(xì)胞團(tuán)在顯微鏡下挑至96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，轉(zhuǎn)移至6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，待后續(xù)鑒定。

首先進(jìn)行基因組鑒定分析，根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作，采用康為世紀(jì)試劑盒提取基因組DNA，根據(jù)插入位點(diǎn)設(shè)計(jì)不同的不同引物進(jìn)行鑒定。引物序列見(jiàn)表3。

然后進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)水平分析：①流式細(xì)胞分析：將篩選得到的單克隆細(xì)胞系胰酶消化后，重懸于流式細(xì)胞緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。②熒光顯微鏡觀察：將陽(yáng)性克隆種在共聚焦專(zhuān)用培養(yǎng)皿中，次日使用熒光顯微鏡觀察EGFP的熒光強(qiáng)度。

1.6 細(xì)胞因子及藥物處理

將陽(yáng)性細(xì)胞系E10，B4和B16接種至6孔板，分別用 IFN-γ 20 μg·L-1處理 48 h、奧沙利鉑2 mmol·L-1處理48 h和TNF-α 20 μg·L-1處理3 h后，與處理相同時(shí)間的溶劑（DMSO）對(duì)照組同時(shí)收樣進(jìn)行后續(xù)的流式和PCR實(shí)驗(yàn)。

Tab.2 Sequence of primers for target fragments and vector fragments amplification

Tab.3 Sequence of primers for genomic PCR

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）分析

細(xì)胞用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，對(duì)目的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)程序如下：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因GAPDH的mRNA的表達(dá)水平采用 2-ΔCt表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部實(shí)驗(yàn)均經(jīng)至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行，其中組間差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRlSPR-Cas9 載體和CRlS-PlTCh（v2）載體的鑒定

CRISPR-Cas9介導(dǎo)的微同源末端連接基因敲入需要2個(gè)載體，載體的主要結(jié)構(gòu)和構(gòu)建過(guò)程如圖2A和B所示。其中CRISPR-Cas9載體包含敲入位置的sgRNA和PITCh sgRNA，sgRNA用于制造基因組編輯位置的DNA雙鏈斷裂，PITCh sgRNA在供體載體中造成供體片段2端DNA雙鏈斷裂。CRIS-PITCh（v2）為供體載體，包含要插入基因組的DNA片段、2A序列分隔的EGFP和嘌呤霉素抗性基因，該片段2端為編輯位置2側(cè)的同源序列，上下游同源臂均約為25 bp。

將含有Ifngr2sgRNA的寡核苷酸鏈退火后形成DNA雙鏈，然后與BbsI酶切后的pX330A-1x2載體連接，得到載體pX330A-1x2-sgRNA-PAM1和pX330A-1x2-sgRNA-PAM2。用BsaI酶將用于切割供體片段的PITCh sgRNA從載體pX330S-2-PITCh切下，連接入pX330A-1x2-sgRNA載體的BsaI位點(diǎn)，完成CRIPSR-Cas9-PAM1和CRIPSRCas9-PAM2的構(gòu)建。CRIPSR-Cas9載體凝膠電泳結(jié)果如圖2C和D所示，載體測(cè)序證實(shí)CRIPSRCas9-PAM1和CRIPSR-Cas9-PAM2與設(shè)計(jì)序列一致，表明載體構(gòu)建成功。

為獲得供體載體，設(shè)計(jì)了分別包含PITCh sgRNA，Ifngr2-PAM1和Ifngr2-PAM2位點(diǎn)上下游序列的引物，對(duì)PCRIS-PITCh（v2）-FBL載體中的EGFP-2A-Puro進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并與擴(kuò)增后的載體骨架進(jìn)行重組連接獲得CRIS-PITCh（v2）-PAM1和CRIS-PITCh（v2）-PAM2 載體。pCRIS-PITCh（v2）凝膠電泳結(jié)果如圖2E和F所示，載體測(cè)序證實(shí)CRIS-PITCh（v2）-PAM1 和 CRIS-PITCh（v2）-PAM2與設(shè)計(jì)序列一致，表明載體構(gòu)建成功。

Fig.2 lllustration of vector construction for knock-in and agarose gel electrophoresis of constructed vectors.A：construction of CRISPR-Cas9 vector expressing Cas9 nuclease and two sgRNAs，a target locus-specific sgRNA and a generic PITChsgRNA；B：construction of the CRIS-PITCh（v2）vector harboring the desired microhomologies；C：CRISPR-Cas9-PAM1；D：CRISPR-Cas9-PAM2；E：CRIS-PITCh（v2）-PAM1；F：CRIS-PITCh（v2）-PAM2.M：marker.

2.2 穩(wěn)定表達(dá)敲入EGFP標(biāo)記的Ifngr2基因B16細(xì)胞系的鑒定

將2.1中所述CRIPSR-Cas9和其對(duì)應(yīng)的pCRIS-PITCh（v2）質(zhì)粒載體同時(shí)轉(zhuǎn)入小鼠黑素瘤細(xì)胞系B16中。轉(zhuǎn)染后72 h通過(guò)嘌呤霉素篩選陽(yáng)性細(xì)胞。設(shè)計(jì)了3對(duì)PCR引物（圖3A）對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞系進(jìn)行了鑒定。陽(yáng)性克隆可產(chǎn)生3種PCR產(chǎn)物，分別命名為產(chǎn)物1，2和3，其中產(chǎn)物1上游引物位于基因組上，下游引物位于EGFP上，產(chǎn)物分子質(zhì)量約500 bp；產(chǎn)物2和3引物位于上下游基因連接處，產(chǎn)物分子質(zhì)量約1450 bp。克隆E10和B4 PCR結(jié)果如圖3B和C所示，設(shè)計(jì)PCR產(chǎn)物分子質(zhì)量處均出現(xiàn)特異性條帶。將產(chǎn)物1純化后進(jìn)行測(cè)序，使用下游引物測(cè)序，比對(duì)結(jié)果如圖3D和E所示，其中測(cè)序上游是EGFP序列，中間是連接處的同源臂序列，下游是基因組序列，說(shuō)明EGFP序列成功插入基因組目標(biāo)位點(diǎn)。

Fig.3 Verification of lFNGR2-EGFP in B16 cell lines via genomic PCR，flow cytometry and fluorescence microscopy.A：three pairs of primers were designed for genomic knock-in confirmation；B and C：electrophoretic image of genomic PCR（E10 and B4），red arrow pointing to target band；D and E：sequencing results of product 1；F：flow cytometry of the knock-in cells，GFI：green fluorescence intensity；G：knock-in cell imaging using fluorescence microscope.

對(duì)基因組PCR鑒定陽(yáng)性的細(xì)胞系進(jìn)行了流式分析及熒光顯微鏡下觀察。流式結(jié)果如圖3F所示，以B16細(xì)胞為對(duì)照組，紅色范圍內(nèi)為陽(yáng)性細(xì)胞，橫軸表示綠色熒光強(qiáng)度，E10和B4細(xì)胞系綠色熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組，陽(yáng)性率＞95%。熒光觀察結(jié)果如圖3G所示，其中B16細(xì)胞為對(duì)照組，在E10和B4細(xì)胞系中可以成功看到綠色熒光，對(duì)照組則看不到，說(shuō)明插入EGFP序列表達(dá)成功。

2.3 陽(yáng)性克隆細(xì)胞的lFN-γ反應(yīng)性檢測(cè)

為了明確陽(yáng)性細(xì)胞系是否能夠響應(yīng)IFN-γ的刺激，對(duì)陽(yáng)性克隆E10和B4進(jìn)行IFN-γ（20 μg·L-1）處理48 h并檢測(cè)下游靶基因Cd274（PDL1）和Psmb9的表達(dá)。如圖4所示，以B16細(xì)胞為對(duì)照，縱坐標(biāo)表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。IFN-γ刺激后，Cd274（PDL1）在E10和B4細(xì)胞中顯著上調(diào)了63和138倍，Psmb9在E10和B4細(xì)胞中顯著上調(diào)了2885和4616倍，上調(diào)幅度與B16母細(xì)胞相當(dāng)，說(shuō)明E10和B4細(xì)胞能夠響應(yīng)IFN-γ刺激，表明細(xì)胞中IFN-γ信號(hào)通路完整。

Fig.4 Real time PCR（RT-PCR）of interferon-γ（lFN-γ）target gene Cd274 and Psmb9 in knock-in cells（E10 and B4）and B16 parental cells.A：analysis of Cd274 in cells with or without IFN-γ 20 μg·L-1treatment；B：analysis of Pmsb9 in cells with or without IFN-γ treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding cell control group.

2.4 TNF-α和奧沙利鉑上調(diào)陽(yáng)性克隆細(xì)胞中l(wèi)fngr2和EGFP的表達(dá)

將細(xì)胞克隆E10和B4分別用TNF-α和奧沙利鉑刺激后進(jìn)行流式細(xì)胞分析，同時(shí)提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。流式結(jié)果如圖5A和E所示，紅色為對(duì)照組B16，綠色為未加刺激的陽(yáng)性細(xì)胞系，橙色為加藥刺激的陽(yáng)性細(xì)胞系，橫軸表示綠色熒光強(qiáng)度。陽(yáng)性克隆E10和B4細(xì)胞系加藥刺激后的綠色熒光峰值均有右移，說(shuō)明EGFP表達(dá)增加。計(jì)算E10和B4主細(xì)胞群的平均熒光強(qiáng)度值，TNF-α處理后，E10和B4細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度由3845和4456上升到5720和5972；奧沙利鉑處理后，E10和B4細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度由3032和2786上升到4285和4179，因此TNF-α和奧沙利鉑處理使E10和B4細(xì)胞的熒光顯著增強(qiáng)（圖5B和F）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，TNF-α刺激后，Ifngr2在B16，E10和B4細(xì)胞中分別上升11.40，9.31和21.39倍，EGFP在E10和B4細(xì)胞中分別上升了2.50和5.37倍；奧沙利鉑刺激后，Ifngr2在B16，E10和B4中細(xì)胞分別上升10.99，3.54和5.39倍，EGFP在E10和B4細(xì)胞中分別上升2.70和2.44倍；IFN-γ處理不能上調(diào)Ifngr2和EGFP的表達(dá)（圖5C，D，G，H，I和J）。以上結(jié)果表明，陽(yáng)性克隆細(xì)胞系細(xì)胞中綠色熒光的強(qiáng)度可以特異性地反映細(xì)胞中Ifngr2的表達(dá)水平。

Fig.5 Ifngr2 and EGFP upregulated by tumor necrosis factor-α（TNF-α）and oxaliplatin（Oxal）.A and E：flow cytometry analysis of the fluorescence of cells with Oxal 2 mmol·L-1（A），TNF-α 20 μg·L-1（E）or without treatment.B and F：statistical results of flow cytometry observation.MFI：mean fluorescence intensity.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.C，D，G，H，I and J：results of RT-PCR on the indicated genes before and after stimulation.TNF-α and Oxal could upregulate the expression of Ifngr2 and EGFP.But IFN-γ couldn’t.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding cell control group.

3 討論

IFN-γ是由自然殺傷細(xì)胞和激活的效應(yīng)T細(xì)胞分泌的一類(lèi)細(xì)胞因子，在機(jī)體的免疫過(guò)程中發(fā)生著十分重要的作用[11-14]。IFN-γ能夠促進(jìn)組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(lèi)及Ⅱ類(lèi)抗原的加工提呈，因此提高機(jī)體的免疫監(jiān)視功能[15]。IFN-γ能夠調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的應(yīng)答，協(xié)調(diào)固有免疫反應(yīng)向獲得性免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)化[16]。除此之外，IFN-γ還能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，影響免疫反應(yīng)。

近年來(lái)研究證明，IFN-γ信號(hào)通路在腫瘤的免疫治療中具有十分重要的作用。GAO等[1]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中IFN-γ信號(hào)通路的缺失導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐受，從而導(dǎo)致抗CTLA4治療的失敗。BENCI等[3]發(fā)現(xiàn)，IFN-γ信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫檢查點(diǎn)藥物的敏感性。此外，ZARETSK等[2]也報(bào)道了在黑素瘤細(xì)胞IFN-γ信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的異常，導(dǎo)致抗PD-1治療失敗。IFNGR1在細(xì)胞中高表達(dá)，IFNGR2的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，可以對(duì)IFN-γ信號(hào)通路實(shí)施調(diào)控，進(jìn)而影響腫瘤免疫效果。因此，研究IFNGR2的表達(dá)調(diào)控具有十分重要的意義。

基因編輯技術(shù)是指在細(xì)胞基因組靶位點(diǎn)引入核酸序列變化的一類(lèi)技術(shù)，其核心為在打靶位置引入DNA雙鏈斷裂，應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制，引入對(duì)該位置的基因插入、缺失、替換等。同源重組基因編輯技術(shù)應(yīng)用細(xì)胞中的同源重組修復(fù)機(jī)制，可以精確的實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的替換，已經(jīng)在人多功能干細(xì)胞[17-18]和小鼠[19]等細(xì)胞中應(yīng)用。但是，基因重組其所需同源臂較長(zhǎng)（至少200 bp），載體構(gòu)建困難，編輯效率較低。本研究所采取的CRISPR-Cas9介導(dǎo)的微同源末端連接敲入技術(shù)，利用的是細(xì)胞內(nèi)另一種DNA損傷修復(fù)機(jī)制——微同源末端連接，該機(jī)制可以通過(guò)～25 bp的同源臂將DNA片段連入雙鏈斷裂區(qū)域，實(shí)現(xiàn)基因敲入，載體構(gòu)建簡(jiǎn)單，編輯效率高。本研究采用RNA引導(dǎo)的CRISPR-Cas9實(shí)現(xiàn)基因組雙鏈DNA斷裂，與鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)物核酸酶和第一代RNA引導(dǎo)的CRISPR-Cas核酸酶相比，切割更為高效，可應(yīng)用的細(xì)胞種類(lèi)更多。CRISPR-Cas9介導(dǎo)的微同源末端連接敲入技術(shù)已經(jīng)在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物動(dòng)物細(xì)胞中得到了成功應(yīng)用[20-21]。

在抗生素篩選得到了敲入細(xì)胞系的候選單克隆后，從基因組水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平篩選EGFP正確敲入的陽(yáng)性克隆。PCR結(jié)果顯示，PAM1獲得的陽(yáng)性克隆較多，PAM2陽(yáng)性克隆較少，提示PAM1和PAM2 2個(gè)靶位點(diǎn)的編輯效率存在一定差異。在蛋白質(zhì)表達(dá)水平，通過(guò)流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡觀察候選克隆的綠色熒光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使PCR結(jié)果均為陽(yáng)性的克隆，其熒光強(qiáng)度也有差異，因此保留了熒光強(qiáng)度不同的細(xì)胞克隆，其中E10和B4陽(yáng)性細(xì)胞克隆綠色熒光強(qiáng)度中等。不同熒光強(qiáng)度的克隆將可能適用于不同的篩選需求，其綠色熒光強(qiáng)度水平的差異可能與細(xì)胞克隆差異和細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)調(diào)控機(jī)制相關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

TNF-α和奧沙利鉑都是用來(lái)治療腫瘤的藥物，已有文獻(xiàn)提示它們均可促進(jìn)抗腫瘤免疫治療的效果。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α和奧沙利鉑處理使E10和B4細(xì)胞中的Ifngr2mRNA水平顯著上調(diào)，提示TNF-α和奧沙利鉑促進(jìn)腫瘤免疫治療效果可能是通過(guò)上調(diào)Ifngr2水平進(jìn)而增強(qiáng)IFN-γ信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，在這2株細(xì)胞系中，TNF-α和奧沙利鉑處理導(dǎo)致EGFPmRNA水平和綠色熒光強(qiáng)度的顯著上調(diào)，與Ifngr2的上調(diào)一致，表明構(gòu)建的細(xì)胞系中綠色熒光的強(qiáng)度可以反映IFNGR2的表達(dá)水平。

作為工具細(xì)胞系，需要驗(yàn)證陽(yáng)性細(xì)胞系中綠色熒光強(qiáng)度對(duì)于IFNGR2的表達(dá)水平的反應(yīng)程度。同時(shí)還需要從其他方面對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞系進(jìn)行鑒定，如上下游通路是否正常激活與響應(yīng)，這仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究采用微同源末端連接基因編輯技術(shù)，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)敲入EGFP的Ifngr2基因的黑素瘤B16細(xì)胞系。該細(xì)胞系具有正常的IFN-γ信號(hào)通路，且其中綠色熒光強(qiáng)度可反映IFNGR2的表達(dá)水平，提示該細(xì)胞可用于IFNGR2表達(dá)及功能調(diào)控研究，為篩選IFNGR2的表達(dá)調(diào)控因子和潛在的抗腫瘤免疫治療藥物提供有力工具。