匹諾塞林對(duì)高血糖誘導(dǎo)的大鼠卒中后出血轉(zhuǎn)化的作用

孔令雷，陳燕霞，，劉楠楠，3，馬國(guó)棟，楊海光，石瑞麗，杜冠華

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050；2.包頭醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014060；3.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

卒中作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，目前仍缺乏有效的治療藥物。組織纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator，t-PA）是目前唯一被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于卒中治療的溶栓藥，有效治療時(shí)間窗為3～4.5 h。臨床研究表明，t-PA可使出血轉(zhuǎn)化（hemorrhagic transformation，HT）的發(fā)生率增加10倍，死亡率達(dá)到60%，只有約3.4%～5.2%卒中患者可接受t-PA治療[1]。HT是急性腦梗死后發(fā)生的腦內(nèi)出血，是卒中的常見嚴(yán)重并發(fā)癥，導(dǎo)致死亡率和致殘率增加。缺血性卒中HT的發(fā)生率高達(dá)48%，主要發(fā)生于初次卒中后2～3 d[2]，是影響患者死亡和預(yù)后的重要原因。HT的發(fā)生既是卒中病理發(fā)展的結(jié)果，也與溶栓藥物的使用和機(jī)體狀態(tài)有關(guān)[3]。臨床對(duì)于HT的治療主要是手術(shù)干預(yù)，但效果較差。因此，尋找預(yù)防和治療HT的藥物對(duì)于卒中的治療和預(yù)后具有重要意義。

高血糖是卒中后不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因子，在HT的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[4]。在卒中患者中，約有40%患者存在糖尿病和高血糖，因而導(dǎo)致死亡率較高，預(yù)后較差。臨床研究表明，高血糖是t-PA溶栓治療后HT發(fā)生的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，高血糖大鼠經(jīng)過大腦中動(dòng)脈堵塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）手術(shù)后出血發(fā)生率達(dá)到100%[6]。高血糖引起HT的機(jī)制主要與酸中毒有關(guān)[7]。此外，高血糖還可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶、活性氧和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致血管損傷并引起出血[8]。

匹諾塞林（pinocembrin）是從蜂膠中提取、通過高通量篩選技術(shù)獲得的一種具有抗腦缺血作用的天然黃酮類化合物，是抗腦缺血Ⅰ類新藥，目前正在進(jìn)行Ⅱ期臨床研究。非臨床研究表明，該藥在多種腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭芯哂锌鼓X缺血作用，可減小腦梗死體積，減輕腦水腫和神經(jīng)功能損傷，改善學(xué)習(xí)記憶能力等，有效治療時(shí)間窗≥6 h[9]。其具有擴(kuò)張血管、抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)線粒體功能、抑制細(xì)胞凋亡和自噬等多方面的作用[10-13]，提示該藥可能通過多個(gè)靶點(diǎn)和通路發(fā)揮作用。本研究集體前期通過t-PA溶栓誘導(dǎo)的大鼠HT模型研究發(fā)現(xiàn)，匹諾塞林能減少大鼠腦梗體積，改善神經(jīng)功能，抑制t-PA誘導(dǎo)的HT的發(fā)生和發(fā)展[14]。為進(jìn)一步明確該藥對(duì)HT的治療作用，本研究制備急性高血糖誘導(dǎo)的大鼠HT模型，觀察其抗HT的作用，以期為擴(kuò)大匹諾塞林的臨床適應(yīng)證提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

SD（Sprague Dawley）大鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量220～240 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動(dòng)物房，明暗交替（12/12 h），環(huán)境溫度22～24℃，相對(duì)濕度為40%～60%，自由進(jìn)食進(jìn)水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。

注射用匹諾塞林（10 mg，批號(hào)：20061101）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供；伊文斯藍(lán)（EB）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）和三氯乙酸購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；血紅蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)博世生物技術(shù)有限公司；線栓購(gòu)于河北天濃生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為雙蒸水。

血糖儀和血糖試紙（羅氏公司）；ALC-HTP動(dòng)物恒溫系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；WZS-50F6雙道微量注射泵（浙江史密斯醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；TX223L電子天平（日本島津公司）；BT100-2J LongerPump（保定蘭格恒流泵有限公司）；連續(xù)光譜酶標(biāo)測(cè)試儀（Molecular公司）；DHX-9243B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 大鼠MCAO模型制備

10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，之后將其仰臥位固定在放有保溫墊的鼠板上。用乙醇棉球擦拭頸部皮膚，頸前正中剪開皮膚約1.5 cm，鈍性分離皮下肌肉和薄膜等，分離頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈。分別在頸總、頸外和頸內(nèi)動(dòng)脈埋線，將頸外系死，頸總和頸內(nèi)動(dòng)脈夾閉，頸外動(dòng)脈剪一小口，插入特制尼龍線，松開頸總和頸內(nèi)動(dòng)脈，將栓線插入18 mm阻塞到大腦中動(dòng)脈，90 min后拔栓進(jìn)行再灌，之后縫合皮膚，放于籠中飼養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、MCAO模型組、高糖+MCAO模型組、高糖+匹諾塞林+MCAO組，每組21只。假手術(shù)組只分離頸動(dòng)脈，不插入線栓；MCAO模型組進(jìn)行MCAO手術(shù)，但不注射葡萄糖；高糖+MCAO模型組在MCAO手術(shù)前30 min腹腔注射50%葡萄糖；高糖+匹諾塞林+MCAO組在高糖模型再灌前5 min尾靜脈注射匹諾塞林。參考在腦缺血模型和t-PA誘導(dǎo)的HT模型中匹諾塞林量效關(guān)系的研究結(jié)果，匹諾塞林10 mg·kg-1作用最顯著，因此本研究選擇該劑量進(jìn)行研究[14]。

1.4 血糖儀測(cè)定血糖

分別于大鼠注射葡萄糖前、后30 min及MCAO術(shù)后1，2和3 h，尾靜脈取血至血糖試紙，用血糖儀測(cè)定血糖。

1.5 行為學(xué)評(píng)分

MCAO術(shù)后24 h，采用改良的大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分法（modified Neurological Severity Scores，mNSS）評(píng)分，觀察大鼠的運(yùn)動(dòng)、感覺和反射功能。運(yùn)動(dòng)功能包括提尾實(shí)驗(yàn)、地板實(shí)驗(yàn)和平衡木實(shí)驗(yàn)。提尾實(shí)驗(yàn)評(píng)分：前肢屈曲（1分），后肢屈曲（1分），30 s內(nèi)頭上仰（1分）；地板實(shí)驗(yàn)評(píng)分：不能走直線（1分），偏癱（1分），旋轉(zhuǎn)（1分）；平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)分：緊抓平衡木邊緣（1分），緊抓平衡木但一肢體從平衡木垂落（2分），緊抓平衡木但二肢體從平衡木上垂落或在平衡木上旋轉(zhuǎn)（＞60 s）（3分），試圖在平衡木上保持平衡但跌落（＞40 s）（4分），試圖在平衡木上保持平衡但跌落（＞20 s）（5分），直接跌落、未嘗試在平衡木上平衡（＜20 s）（6分）。感觸覺實(shí)驗(yàn)評(píng)分：視覺和觸覺放置（1分），本體覺放置（1分）；反射功能測(cè)試評(píng)分：耳廓反射（1分），角膜反射（1分）。

1.6 腦梗死體積測(cè)定

行為學(xué)評(píng)分完畢后，使用10%水合氯醛麻醉，從心尖處注入生理鹽水灌流取腦。將大腦冠狀切成6片，置6孔板中，避光加1%TTC，37℃恒溫染色20 min，4%多聚甲醛固后拍照，用Image J計(jì)算每個(gè)腦切片的梗死面積，并計(jì)算腦梗死體積。腦梗死體積（%）=〔梗死體積-（梗死側(cè)大腦體積-對(duì)側(cè)大腦體積）〕/對(duì)側(cè)大腦體積×100%。

1.7 腦組織血紅蛋白含量檢測(cè)

另取一批大鼠，每組6只，MCAO術(shù)后24 h，同樣灌流取腦，冠狀切片、拍照觀察出血情況，將兩側(cè)腦組織分別稱重并記錄后，置勻漿器中。參考試劑盒說明書操作，以1∶1體積比加0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液勻漿，4℃，12 000×g離心30 min，吸取上清液50 μL于96孔板中，加反應(yīng)試劑200 μL后室溫放置15 min后，在400 nm處測(cè)A400nm值，按試劑盒說明書計(jì)算獲得血紅蛋白含量。

1.8 HE染色觀察腦組織的病理變化

每組取3只大鼠，MCAO術(shù)后24 h，同樣灌流取腦，4%多聚甲醛灌流固定后，取全腦，置4%多聚甲醛中，石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色，觀察腦組織的病理變化。

1.9 腦組織EB含量測(cè)定

另取一批大鼠，每組6只，MCAO術(shù)后24 h，尾靜脈注射4%EB，2 h后，同樣灌流取腦，冠狀切片、拍照觀察EB滲漏情況。將兩側(cè)腦組織分別稱重并記錄后，置勻漿器中，以1∶3體積比加50%三氯乙酸勻漿，4℃，12 000×g離心5 min后，吸取上清液100 μL于96孔板中，在620 nm處測(cè)A620nm值。標(biāo)準(zhǔn)曲線通過在正常大鼠腦組織勻漿中加不同濃度EB制備。

1.10 出血發(fā)生率和死亡率的統(tǒng)計(jì)

全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)造模成功的大鼠數(shù)量，造模成功后死亡的大鼠數(shù)量，通過腦切片觀察出血情況并統(tǒng)計(jì)發(fā)生出血的大鼠數(shù)量。出血發(fā)生率（%）=發(fā)生出血的大鼠數(shù)量/造模成功的大鼠數(shù)量×100%；死亡率（%）=造模成功后死亡的大鼠數(shù)量/造模成功的大鼠數(shù)量×100%。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用GraphPad Prism軟件單因素方差分析（one-way ANOVA）及組間t檢驗(yàn)分析各組數(shù)據(jù)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 匹諾塞林對(duì)急性高血糖MCAO模型大鼠血糖水平的影響

為保證高血糖模型的成功，首先檢測(cè)了不同時(shí)間點(diǎn)血糖值的變化（圖1）。與假手術(shù)組相比，MCAO模型組各時(shí)間點(diǎn)血糖水平均無明顯變化；高糖+MCAO模型組大鼠腹腔注射葡萄糖30 min后，血糖由注射前的4.0升高至20.9 mmol·L-1，隨后隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降；注射后各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于MCAO模型組（P＜0.01），表明急性高血糖MCAO模型制備成功。高糖+匹諾塞林+MCAO組血糖與高糖+MCAO模型組比較無明顯變化，表明匹諾塞林對(duì)急性高血糖MCAO模型大鼠血糖水平無明顯作用。

Fig.1 Effect of pinocembrin（Pino）on blood glucose at different time points in acute hyperglycemic（HG）middle cerebral artery occlusion（MCAO）model rats.Rats were randomly divided into sham group，MCAO group，HG+MCAO group and HG+Pino+MCAO group.The rats in HG+MCAO group received an intraperitoneal injection of 50%glucose（6 mL·kg-1）.Pino（10 mg·kg-1）was administrated 5 min before reperfusion.Before injection of glucose，30 min after injection and 1，2 and 3 h after MCAO，blood was collected from the tail vein and blood glucose was measured with blood glucose meter.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with sham group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MCAO group.

2.2 匹諾塞林對(duì)急性高血糖MCAO模型大鼠神經(jīng)功能的影響

術(shù)后24 h采用mNSS評(píng)分法觀察匹諾塞林對(duì)模型大鼠神經(jīng)功能的作用（圖2）。假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能損傷；MCAO模型組行為學(xué)評(píng)分為9.4±1.5，明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）；高糖+MCAO模型組的行為學(xué)評(píng)分為10.0±0.6，與MCAO模型組比較無明顯變化，表明高血糖并未加重神經(jīng)功能損傷；高糖+匹諾塞林+MCAO組大鼠行為學(xué)評(píng)分降至7.4±1.1，與高糖+MCAO模型組比較明顯降低（P＜0.01），表明匹諾塞林具有改善急性高血糖MCAO模型大鼠神經(jīng)功能的作用。

Fig.2 Effect of pino on neurological function in acute hyperglycemic MCAO model rats.See Fig.1 for the rat treatment.mNSS：modified Neurological Severity Scores.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with sham group；##P＜0.01，compared with HG+MCAO group.

2.3 匹諾塞林對(duì)急性高血糖MCAO模型大鼠腦梗死體積的影響

假手術(shù)組大鼠無腦梗變化；缺血1.5 h后，MCAO模型組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯腦梗，腦梗體積為（23.3±11.3）%（P＜0.01）；高糖+MCAO模型組大鼠腦梗體積與MCAO模型組相比進(jìn)一步增加（P＜0.05），達(dá)到（36.9±8.2）%；高糖+匹諾塞林+MCAO組大鼠腦梗體積降至（26.9±5.8）%，與高糖+MCAO模型組比明顯降低（P＜0.05）（圖3A和3B）。

Fig.3 Effect of pino on infarct volume in acute hyperglycemic MCAO model rats.See Fig.1 for the rat treatment.A：representative TTC stained images；B：bar graph of infarct volume.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with sham group；#P＜0.05，compared with MCAO group；ΔP＜0.05，compared with HG+MCAO group.

2.4 匹諾塞林對(duì)急性高血糖MCAO模型大鼠腦組織中血紅蛋白含量的影響

假手術(shù)組大鼠無腦出血；缺血1.5 h后MCAO模型組大鼠有輕微腦出血，與假手術(shù)組相比無明顯變化；與MCAO模型組相比，高糖+MCAO模型組大鼠腦組織內(nèi)血紅蛋白含量明顯升高（P＜0.01）；高糖+匹諾塞林+MCAO模型組大鼠腦出血與高糖+MCAO模型組相比明顯減輕（P＜0.01）（圖4A和圖4B）。HE染色結(jié)果（圖4C）也表明，MCAO模型組出血輕微，高糖+MCAO模型組出血嚴(yán)重，高糖+匹諾塞林+MCAO模型組較高糖+MCAO模型組出血減輕。以上結(jié)果均提示，匹諾塞林具有抑制高血糖誘導(dǎo)出血發(fā)生的作用。

Fig.4 Effect of pino on hemorrhagic transformation（HT）in acute hyperglycemic MCAO model rats.See Fig.1 for the rat treatment.A：representative images of HT；B：bar graph of hemoglobin；C：representative images of HE staining.The arrows represent bleeding.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with sham group；##P＜0.01，compared with MCAO group；ΔΔP＜0.01，compared with HG+MCAO group.

2.5 匹諾塞林對(duì)急性高血糖MCAO模型大鼠腦組織中EB含量的影響

缺血1.5 h后，MCAO模型組大鼠腦組織中EB含量與假手術(shù)組比無顯著性差異；高糖+MCAO模型組大鼠腦組織中EB含量與MCAO模型組相比顯著增加（P＜0.05），高糖+匹諾塞林+MCAO模型組與高糖+MCAO模型組相比顯著降低（P＜0.05），表明匹諾塞林能保護(hù)血腦屏障（blood brain barrier，BBB）（圖5A和5B）。

Fig.5 Effect of pino on Evans blue（EB）leakage in acute hyperglycemic MCAO model rats.See Fig.1 for the rat treatment.A：representative images of EB；B：bar graph of EB.x ± s，n=6.＊P＜0.05，compared with MCAO group，#P＜0.05，compared with HG+MCAO group.

2.6 匹諾塞林對(duì)急性高血糖MCAO模型大鼠出血發(fā)生率和死亡率的影響

全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)大鼠出血發(fā)生率和死亡率。從出血發(fā)生率來看，MCAO模型組出血發(fā)生率為18.2%，高糖+MCAO模型組出血發(fā)生率高達(dá)95.4%，高糖+匹諾塞林+MCAO模型組出血發(fā)生率降至59.1%（圖6A）。大鼠死亡率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，MCAO模型組大鼠死亡率為16.7%，高糖+MCAO模型組的死亡率升至57.3%，高糖+匹諾塞林+MCAO模型組的死亡率可降至18.9%（圖6B）。以上結(jié)果表明，匹諾塞林不僅降低出血發(fā)生率，還可以降低大鼠死亡率。

Fig.6 Effect of pino on hemorrhagic transformation（HT）rate（A）and mortality rate（B）of acute hyperglycemic MCAO model rats.See Fig.1 for the rat treatment.

3 討論

在影響卒中的各種風(fēng)險(xiǎn)因素中，卒中發(fā)作后24 h內(nèi)高于7 mmol·L-1的血糖水平與腦損傷的惡化和死亡率的增加相關(guān)[15]。高血糖癥可由糖尿病引起，也可來自食物攝入、葡萄糖輸注、生理應(yīng)激或皮質(zhì)類固醇的使用。糖尿病患者的卒中風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，比一般人群高4～12倍。此外，由于全身應(yīng)激反應(yīng)和糖皮質(zhì)激素水平升高，20%～50%卒中患者會(huì)出現(xiàn)高血糖[16]。上述研究說明，高血糖是通過升高葡萄糖而非糖尿病并發(fā)癥加重卒中損傷。已有研究表明，高血糖是卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[17]，同時(shí)血清葡萄糖和糖尿病也是t-PA溶栓后HT的預(yù)測(cè)因子。

目前用于HT研究的動(dòng)物模型主要有急性高血糖MCAO模型、糖尿病MCAO模型和t-PA溶栓誘導(dǎo)的HT模型。t-PA誘導(dǎo)的HT模型與t-PA的給藥時(shí)間密切相關(guān)，隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)HT的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，但無法達(dá)到100%的成模率，且t-PA成本較高。糖尿病MCAO模型需先建立糖尿病模型，再進(jìn)行MCAO手術(shù)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。急性高血糖MCAO模型通過術(shù)前30 min腹腔注射50%葡萄糖即可成功建立HT模型，且成模率接近100%，簡(jiǎn)單易行，適用于HT治療藥物的評(píng)價(jià)。本研究采用急性高血糖誘導(dǎo)的HT模型，HT發(fā)生率為95.4%，表明模型建立成功，可用于藥物的評(píng)價(jià)。在此基礎(chǔ)上，觀察了匹諾塞林對(duì)HT的作用，發(fā)現(xiàn)其能降低腦梗體積和出血。從HT的發(fā)生率、嚴(yán)重程度和大鼠生存率來看，匹諾塞林作用顯著。該藥使HT發(fā)生率從95.4%降至59.1%，生存率從42.7%提高到81.1%，且顯著降低出血的嚴(yán)重程度。上述結(jié)果表明，匹諾塞林對(duì)高血糖誘導(dǎo)的HT具有顯著的保護(hù)作用。

HT的發(fā)生機(jī)制與BBB的破壞相關(guān)[18]。高血糖可增加活性氧并引發(fā)其依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。高血糖通過誘導(dǎo)酸中毒，增加神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的損傷[15，19]。此外高血糖還可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的激活[20]。這些因素的共同作用導(dǎo)致了BBB的破壞和神經(jīng)細(xì)胞的死亡，促進(jìn)HT的發(fā)生。通過檢測(cè)腦組織中EB含量證實(shí)高血糖可加重BBB損傷，導(dǎo)致EB滲漏進(jìn)一步增加，而匹諾塞林顯著降低EB含量，提示其對(duì)BBB具有保護(hù)作用，進(jìn)而抑制HT的發(fā)生。此外，在本研究中通過檢測(cè)血糖水平發(fā)現(xiàn)，匹諾塞林對(duì)于注射葡萄糖引起的高血糖水平并無降低作用，表明其并不是通過調(diào)節(jié)血糖發(fā)揮抗HT作用，可能存在其他作用途徑。前期研究發(fā)現(xiàn)，匹諾塞林具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用，可以通過多靶點(diǎn)多途徑保護(hù)神經(jīng)血管單元[11]。因此推測(cè)，匹諾塞林對(duì)于高血糖引起的HT的治療作用也是通過多靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的，其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，匹諾塞林可減輕高血糖誘導(dǎo)的HT，降低出血的發(fā)生率和死亡率，可能是一種具有潛力的抗HT藥物。本研究為擴(kuò)大匹諾塞林的臨床適應(yīng)證提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。