腦缺血急性期神經(jīng)血管單元的變化及三七干預(yù)作用研究

梁萍 黃清 農(nóng)立宇 林軍 蒙蘭青

缺血性腦卒中是臨床常見病，約占全球死亡總數(shù)的11%，且由于人們生活習(xí)慣、飲食、作息時(shí)間的不規(guī)律，缺血性腦卒中愈益年輕化，嚴(yán)重威脅人們的身體健康[1]。隨著醫(yī)學(xué)水平的不斷提高，人們發(fā)現(xiàn)具有多重藥理作用的三七在治療腦缺血再灌注損傷（ischemic/reperfusion，I/R）中發(fā)揮重要作用。三七是五加科人參屬草本植物，含有人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1 等活性成分，可通過抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載、清除自由基、抗炎、保護(hù)血腦屏障及抑制細(xì)胞凋亡等作用于缺血性腦卒中病理過程多個(gè)環(huán)節(jié)，協(xié)同促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）的修復(fù)，從而減輕腦缺血損傷[2]。但目前尚無三七整體活性物質(zhì)用于腦I/R損傷的治療方法。本研究中，我們通過制作腦I/R損傷大鼠模型，觀察大鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)、腦梗死體積百分比、NVU 超微結(jié)構(gòu)變化，探討腦I/R 后NVU 的變化及三七干預(yù)對(duì)大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠70只，體重（250± 30）g，購(gòu)自湖南省長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（湘）2014-0011。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格執(zhí)行《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理辦法》。

1.2 藥品與主要試劑三七粉（批號(hào)：160922，文山市苗鄉(xiāng)三七實(shí)業(yè)有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（批號(hào)：20180604，北京索萊寶生物科技有限公司）；水合氯醛（批號(hào)：2015031101，成都市科龍化工試劑廠）；多聚甲醛（批號(hào)：20180730，北京索萊寶生物科技有限公司）；無水乙醇、丙酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；812 包埋劑（批號(hào)：90529-77-4，SPI公司）。

1.3 儀器Leica UC7型超薄切片機(jī)（Leica公司）；Ultra 45°型鉆石切片刀（Daitome公司）；HT7700型透射電子顯微鏡（HITACHI公司）。

1.4 方法

1.4.1 分組 SPF級(jí)SD 雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組、三七組。假手術(shù)組、對(duì)照組均分為干預(yù)前、干預(yù)后亞組；三七組又分為低（50mg/kg）、中（100mg/kg）和高劑量組（150mg/kg）。每個(gè)小組大鼠10只。

1.4.2 腦缺血損傷模型的制備 對(duì)照組和三七組大鼠參考Zea Longa 制作大鼠局灶性大腦中動(dòng)脈缺血模型[3]：SD 雄性大鼠在造模前喂養(yǎng)10d，術(shù)前12h禁飼料、4h 禁水，10%水合氯醛（0.0035ml/g）腹腔麻醉大鼠，備皮消毒，頸部正中作一切口，逐層分離皮下筋膜、肌肉、右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈；結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈近心端、頸外動(dòng)脈近心端，夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端；在右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎與夾閉之間剪開一小口，并將一根直徑0.235mm、長(zhǎng)4.8cm、頭部圓鈍的線栓緩慢送入右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，深度為18～19mm；縫合線系緊線栓，消毒、縫合切口。缺血2h 后緩慢拔出線栓約1cm，剪去皮外多余線栓，完成腦缺血再灌注損傷制備。假手術(shù)組線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈深度為8～10mm，未造成腦缺血。各組大鼠Zea Longa 5級(jí)神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分為0分或者4 分者均用同批次大鼠及時(shí)補(bǔ)足10只。

1.4.3 干預(yù)措施 三七組3個(gè)亞組大鼠在腦缺血再灌注2h 后分別按大鼠體重取用三七粉（50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg），并用生理鹽水稀釋配成終濃度為5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml 的溶液灌胃，之后每天2次；對(duì)照組干預(yù)后亞組、假手術(shù)組干預(yù)后亞組大鼠在相同的時(shí)間點(diǎn)給予等量生理鹽水灌胃。其余大鼠不做處理。術(shù)后干預(yù)7d。

1.4.4 神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分 再灌注7d 時(shí)根據(jù)Zea Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分。

1.4.5 TTC染色測(cè)定大鼠腦梗死體積百分比 7d 后對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉、斷頭取腦，快速清除表面血跡，去除嗅球、小腦、低位腦干；先后經(jīng)過冷凍、冠狀位切片、染色等步驟后予生理鹽水終止染色，4%多聚甲醛固定；24h 后拍照；采用Image-Pro Plus 6.0圖片分析軟件計(jì)算腦梗死體積百分比。

1.4.6 透射電鏡觀察腦細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 干預(yù)7d 后，進(jìn)行腹腔麻醉、心臟放血、斷頭取腦，將裁剪腦組織置入電鏡液固定，1%鋨酸·0.1M 磷酸緩沖液固定，先后經(jīng)過酒精、丙酮脫水，丙酮、812 包埋劑滲透，包埋，切片，染色后在透射電鏡下觀察、分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用±s表示，各組數(shù)據(jù)在滿足正態(tài)分布和方差齊性時(shí)，組間采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q 檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠I/R損傷模型的建立三七組、對(duì)照組大鼠造模成功表現(xiàn)為病灶對(duì)側(cè)前肢不能完全伸直，或行走時(shí)向病灶對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒。

2.2 各組大鼠再灌注后Zea Longa 神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分比較干預(yù)7d 后評(píng)分顯示，假手術(shù)組干預(yù)前后神經(jīng)功能缺損評(píng)分均為0；對(duì)照組干預(yù)前后神經(jīng)功能評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；三七組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分逐漸改善，明顯低于同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；三七中、高劑量組與低劑量組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但中、高劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠再灌注后神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠再灌注后神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分比較（±s，n=10）

注：與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組干預(yù)后比較，▲P＜0.01；與同時(shí)間點(diǎn)50mg/kg劑量組比較，#P＜0.01

時(shí)間 假手術(shù)組 對(duì)照組 三七組干預(yù)前 干預(yù)后 干預(yù)前 干預(yù)后 50mg/kg 100mg/kg 150mg/kg再灌注2h 0 0 2.10±0.32 1.90±0.58 1.89±0.60 1.90±0.58 1.60±0.52干預(yù)7d 0 0 1.30±0.26 1.25±0.26 0.90±0.21▲ 0.65±0.24▲# 0.50±0.00▲#

2.3 各組大鼠腦梗死體積變化比較假手術(shù)組干預(yù)前后均未見梗死灶，其他各組均有不同程度的梗死灶形成。對(duì)照組干預(yù)前平均腦梗死體積百分比為41.68%，干預(yù)后平均腦梗死體積百分比為39.72%，與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；三七低、中、高劑量組平均腦梗死體積百分比分別為25.67%、15.07%、8.36%，與對(duì)照組干預(yù)后相比，腦梗死體積百分比降低，且呈劑量依賴關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 各組大鼠NVU超微結(jié)構(gòu)變化比較

2.4.1 各組大鼠神經(jīng)元電鏡下形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞核核膜清晰，染色質(zhì)分布均勻，電子密度低，線粒體有輕微擴(kuò)張，線粒體嵴尚清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴(kuò)張。對(duì)照組干預(yù)前亞組神經(jīng)元周圍水腫嚴(yán)重、成片狀空白溶解區(qū)；細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞器流失；細(xì)胞核皺縮，染色質(zhì)分布尚均勻；線粒體中度腫脹，結(jié)構(gòu)模糊，大部分細(xì)胞器溶解破壞。對(duì)照組干預(yù)后亞組細(xì)胞核尚完整、核膜尚清晰，但核內(nèi)常染色質(zhì)減少，異染色質(zhì)增多，大部分線粒體嵴斷裂消失，呈空泡樣改變，胞質(zhì)內(nèi)溶酶體數(shù)量明顯增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴(kuò)張，結(jié)構(gòu)模糊，高爾基體數(shù)目減少。三七低劑量組神經(jīng)元細(xì)胞核核膜較為清晰，染色質(zhì)分布均勻；線粒體有明顯腫脹擴(kuò)張，部分嵴消失、斷裂，呈空泡化改變；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴(kuò)張（同高爾基體），部分結(jié)構(gòu)破壞，有核糖體脫失。三七中劑量組核膜較為清晰，細(xì)胞核分裂，團(tuán)塊狀核仁邊集，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴(kuò)張，細(xì)胞狀態(tài)較低劑量組好。三七高劑量組細(xì)胞核核膜清晰，細(xì)胞核分裂，染色質(zhì)分布均勻，電子密度低，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)輕微擴(kuò)張。見圖1。

圖1 各組大鼠神經(jīng)元電鏡下超微結(jié)構(gòu)圖（×2500）

2.4.2 各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞電鏡下形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組星形膠質(zhì)細(xì)胞胞核大，橢圓形，核膜清晰完整，細(xì)胞核稍皺縮，染色質(zhì)輕微碎裂，邊集；細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整；胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，線粒體輕微擴(kuò)張，嵴清晰可見，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)輕微疏松擴(kuò)張。對(duì)照組干預(yù)前亞組星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯呈水腫、空泡化改變，細(xì)胞核呈異形改變，核內(nèi)空洞形成，線粒體明顯腫脹、空泡化，高爾基體重度腫脹擴(kuò)張（板層結(jié)構(gòu)消失），粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，出現(xiàn)大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡。對(duì)照組干預(yù)后亞組星形膠質(zhì)細(xì)胞整體狀態(tài)不佳，水腫現(xiàn)象嚴(yán)重；核皺縮明顯，核膜結(jié)構(gòu)不清晰，核染色質(zhì)輕微碎裂、邊集；細(xì)胞膜斷裂，細(xì)胞器流失，線粒體重度腫脹擴(kuò)張，嵴消失，呈空泡化改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴(kuò)張，高爾基體明顯腫脹，結(jié)構(gòu)紊亂。三七低劑量組星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍水腫，細(xì)胞核輕度皺縮，線粒體重度擴(kuò)張（損傷程度大于中、高劑量組），大部分線粒體嵴斷裂消失并呈空泡化改變，高爾基體重度擴(kuò)張（板層結(jié)構(gòu)消失），粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡（與中、高劑量組相似），見1個(gè)自噬溶酶體。三七中劑量組星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍明顯呈水腫、空泡化改變；細(xì)胞外形不規(guī)則，胞核皺縮，細(xì)胞核呈異形改變；線粒體有中度腫脹擴(kuò)張，嵴消失，呈空泡化改變，高爾基體腫脹擴(kuò)張（板層結(jié)構(gòu)尚存），粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，出現(xiàn)大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡，水腫損傷程度輕于低劑量組。三七高劑量組星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍輕度水腫、空泡化改變，細(xì)胞核呈異形改變，線粒體有中度腫脹擴(kuò)張，嵴消失，部分呈空泡化改變，高爾基體中度腫脹擴(kuò)張，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，出現(xiàn)中等量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡。見圖2。

2.4.3 各組大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞電鏡下形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組微血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍無水腫，致密間隙無擴(kuò)大，基底膜連續(xù)，管腔基本正常，細(xì)胞核無明顯皺縮，線粒體輕微腫脹。對(duì)照組干預(yù)前亞組微血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍水腫嚴(yán)重，可見空泡狀或空白區(qū)，緊密連接破壞，通透性增加，管腔尚可。對(duì)照組干預(yù)后亞組微血管內(nèi)皮細(xì)胞變形明顯，周圍結(jié)構(gòu)溶解、水腫嚴(yán)重，核固縮，管腔重度狹窄，線粒體輕度腫脹，結(jié)構(gòu)模糊。三七低劑量組微血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍無明顯水腫現(xiàn)象，基底膜尚連續(xù)，胞核不規(guī)則改變，管腔中度狹窄，線粒體結(jié)構(gòu)模糊。三七中劑量組細(xì)胞外形較低劑量組規(guī)則，周圍無水腫，致密間隙無擴(kuò)大，基底膜連續(xù)、薄厚均勻，胞核固縮，管腔輕度狹窄，線粒體結(jié)構(gòu)模糊。三七高劑量組微血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍輕度水腫，但細(xì)胞變形不明顯，管腔基本通暢，線粒體結(jié)構(gòu)正常，嵴清晰。見圖3。

圖2 各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞電鏡下超微結(jié)構(gòu)圖（×2500）

圖3 各組大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞電鏡下超微結(jié)構(gòu)圖（×2500）

3 討論

神經(jīng)元是中樞系統(tǒng)信息接收、傳遞的關(guān)鍵[4]；星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是神經(jīng)元存活、血管再生介質(zhì)的基礎(chǔ)，是腦缺血損傷后神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)調(diào)節(jié)的極好備用資源[5]；血管系統(tǒng)為腦細(xì)胞輸送氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，共同形成的血腦屏障是NVU 發(fā)揮作用的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)。腦缺血再灌注損傷后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，進(jìn)一步導(dǎo)致的血管痙攣加劇腦缺血所致的缺血缺氧損傷。腦缺血后的逐層放大效應(yīng)可逐漸累及毛細(xì)血管周邊的星形膠質(zhì)細(xì)胞，繼而凋亡的星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性殺死鄰近的神經(jīng)元。腦I/R損傷是缺血性腦卒中重要的發(fā)生過程，興奮性毒性損傷、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等過程貫穿了缺血性腦卒中病理過程各個(gè)環(huán)節(jié)，最終導(dǎo)致不可逆的腦細(xì)胞凋亡[6]。凋亡過程涉及神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞及基質(zhì)成分；神經(jīng)血管單元作為腦I/R損傷的整體治療模型強(qiáng)調(diào)了整體保護(hù)的重要性[7]。

研究證實(shí)，三七治療腦缺血損傷療效顯著。人參皂苷Rg1、Rb1、三七皂苷R1 配伍具有協(xié)同抗腦缺血損傷作用，顯著對(duì)抗腦I/R 急性期的能量代謝障礙[8]。三七皂苷R1 通過抑制鈣離子內(nèi)質(zhì)網(wǎng)流出通道—IP3 活化，以對(duì)抗因鈣離子過度釋放引起的腦血栓形成[9]。三七多糖可能通過抑制腦缺血后脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)有效緩解腦缺血損傷[10]。腦缺血損傷發(fā)生后，三七成分之一的人參皂苷加速神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，并向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞分化[11]。三七三醇皂苷能夠促進(jìn)血管再生和側(cè)枝循環(huán)的建立，增加缺血區(qū)周邊腦血液供應(yīng)，減小腦梗死體積[12]。人參皂苷Rg1 通過抑制Caspase-3 的表達(dá)明顯減少細(xì)胞凋亡等[13]。三七以其多途徑、多靶點(diǎn)的藥理作用特點(diǎn)促進(jìn)NVU 的修復(fù)，對(duì)于腦缺血再灌注損傷治療過程至關(guān)重要。

我們利用線栓法制作腦缺血損傷大鼠模型，缺血2h、再灌注7d，從大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積百分比、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)方面研究三七的治療效果。結(jié)果顯示，三七可通過減小大鼠腦梗死體積及減輕NVU 超微結(jié)構(gòu)損傷，改善大鼠神經(jīng)功能行為。然而，目前關(guān)于三七對(duì)腦I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用只是初步的認(rèn)識(shí)，其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。本課題組既往已證實(shí)三七可通過增加NVU 組分神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞神經(jīng)元核抗原蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、層黏連蛋白表達(dá)，多靶點(diǎn)促進(jìn)神經(jīng)血管單元修復(fù)，明顯改善神經(jīng)血管單元的超微結(jié)構(gòu)[14]，今后將繼續(xù)深入研究三七如何多途徑作用于腦I/R損傷。