七氟烷對小膠質(zhì)細胞線粒體自噬與活化的影響

何詩朗 鄧杰 黃雪麟 阮祥才，

1華南理工大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院（廣州市第一人民醫(yī)院）麻醉科（廣州510180）；2廣州醫(yī)科大學附屬市第一人民醫(yī)院麻醉科（廣州510180）

七氟烷廣泛運用在臨床麻醉工作中，臨床試驗數(shù)據(jù)表明全麻藥在兒科手術中對大腦發(fā)育不利，尤其是在腦發(fā)育的爆發(fā)［1-2］。2016年美國食品藥品管理局（FDA）稱3 歲以下的幼兒多次反復接觸到麻醉藥會誘發(fā)成年后的學習能力方面的風險［3-4］。七氟烷在臨床上使用的范圍廣泛，其效價強度可用肺泡最低有效濃度（MAC）來衡。在臨床試驗中會使用1.0 MAC、1.3 MAC、1.6 MAC 的七氟烷進行全麻手術的麻醉［5］。在研究七氟烷這種常用麻醉劑在麻醉誘導和麻醉后恢復期是否會改變小鼠的運動中，會使用1 MAC、1.5 MAC、2 MAC 的七氟烷麻醉小鼠［6］；在研究七氟烷導致發(fā)育期小鼠發(fā)生記憶障礙中，使用2.6%七氟烷或1.3%七氟烷處理C57BL/6 乳鼠［7］；有研究表明濃度為1.1%即1 MAC 氟烷抑制了WDR 神經(jīng)元對兩種有害（熱、機械）和非有害刺激的反應［8］；在LU 等［9］處理細胞時，用4.1%即2 MAC 的七氟烷處理神經(jīng)元或突觸體；3.3%七氟烷處理小膠質(zhì)細胞30 min 減少脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）誘導的小膠質(zhì)細胞遷移，降低促炎細胞因子的產(chǎn)生，降低了小膠質(zhì)細胞的活化［10］。對于非小細胞肺腺癌（A549）和腎細胞癌（RCC4）細胞選擇暴露于3.6%七氟烷2 h 檢測對不同腫瘤類型的轉移潛能和化學敏感性［11］。在研究七氟烷突觸后電流的影響時，1 MAC 濃度七氟烷處理時，多能干細胞的衰變時間顯著延長，在1.5 MAC 當量時多能干細胞的振幅和頻率下降［12］。根據(jù)前人研究，七氟烷在臨床、動物以及細胞使用的濃度多為1 ～2 MAC 之間且結合臨床上常用的七氟烷濃度即1.3 MAC，因此擬選擇1.3 MAC 七氟烷濃度作為本研究中的七氟烷濃度是比較合適。

線粒體主要功能是產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP），線粒體自噬在很多疾病中都扮演了很重要的角色，有證據(jù)［13］顯示線粒體損傷與大腦缺血/再灌注后的神經(jīng)功能評分下降有關；有研究顯示線粒體自噬通過抑制海馬區(qū)NLRP3 炎性小體的激活來改善七氟烷誘導的術后認知障礙［14］；THANGARAJ等［15］研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙和線粒體自噬缺陷誘發(fā)HIV-1 TaT 處理的小膠質(zhì)細胞激活。若線粒體自噬功能不足，受損的線粒體累積可導致產(chǎn)生過量的ROS，參與小膠質(zhì)細胞活化過程［16-17］。

大腦中小膠質(zhì)細胞在大腦發(fā)育過程中起重要的作用［18］，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細胞通常保持靜止狀態(tài)。七氟烷（2%vol）連續(xù)鎮(zhèn)靜大鼠12 h，檢測細胞因子誘導的中性粒細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-1、白介素-6（IL-6）等全身炎癥標志物，用Iba-1 激活小膠質(zhì)細胞，來評估大腦中的細胞反應，在脂多糖（LPS）誘導的炎癥模型中，揮發(fā)性麻醉藥七氟烷并沒有使模型神經(jīng)炎癥的衰減［19］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中涉及小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)炎癥，LPS 誘導小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥反應，增加促炎細胞因子的表達和分泌，如TNF-α、IL-1β、IL-6［20］。用2%七氟烷在妊娠15 d 處理孕鼠3 h，能誘導IL-6 mRNA 表達增加，其影響可能會對神經(jīng)元發(fā)育產(chǎn)生長期影響［21］。但也有研究表示暴露于七氟烷麻醉8 h，不能激活小膠質(zhì)細胞［22］。以往研究發(fā)現(xiàn)氣體麻醉劑七氟烷通過下調(diào)海馬中的PPAR-γ來加重小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)炎癥，從而加重慢性間歇性缺氧大鼠模型的認知功能下降［23］。七氟烷對小膠質(zhì)細胞的作用，促進或抑制其活化，仍存在爭議，小膠質(zhì)細胞的激活在眾多疾病包括神經(jīng)炎癥及學習記憶等認知功能障礙中扮演重要角色，臨床上常用的七氟烷濃度能否使小膠質(zhì)細胞激活以及小膠質(zhì)細胞中的線粒體損傷在小兒手術中麻醉藥的毒性作用很值得關注。筆者推測在七氟烷誘導顱內(nèi)炎癥中，特別是七氟烷在幼兒多次接觸的過程中體現(xiàn)出的神經(jīng)毒性作用，很有可能是因為小膠質(zhì)細胞內(nèi)線粒體自噬的缺陷引發(fā)損傷的線粒體清除不足而使小膠質(zhì)激活，從而引起顱內(nèi)炎癥。本研究旨在觀察在臨床使用濃度范圍內(nèi)七氟烷對、小鼠小膠質(zhì)細胞的線粒體狀態(tài)以及自噬情況，揭示如幼兒麻醉出現(xiàn)神經(jīng)毒性作用等臨床問題的原因，從而為吸入麻醉藥物的合理使用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 BV-2 小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及分組小鼠來源的BV-2 小膠質(zhì)細胞獲贈于中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院麻醉科實驗室。收集并計數(shù)處于對數(shù)生長期的BV-2 細胞后以1 × 104個/孔接種至6 孔板培養(yǎng)，在培養(yǎng)箱使用含10%胎牛血清及1%雙抗的杜爾伯科改良伊格爾（DMEM）高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)孵育24 h，待細胞密度到85%左右時，分為不加七氟烷和七氟烷暴露組：按照預實驗確定的給藥濃度和時間，BV-2 小膠質(zhì)細胞在2.6%～2.8%七氟烷中暴露4 h 為七氟烷組，不暴露在七氟烷中的BV-2 小膠質(zhì)細胞為對照組。

1.2 原代小鼠小膠質(zhì)細胞的提取按THANGARAJ等［15］的提取方法取出生第0-1 天的C57BL/6j 乳鼠的大腦，放在冰冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶液中剝除腦膜干凈，把腦組織放到有3 mL DMEM 培養(yǎng)基中剪碎吹打至渾濁液，用40 μm 孔徑的濾網(wǎng)過濾后接種到T75培養(yǎng)皿瓶。48 h后加入25 ng/mL粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）刺激小膠質(zhì)細胞增殖，第10 天即可收半貼壁且透亮的原代小鼠小膠質(zhì)細胞。在第1次收獲小膠質(zhì)細胞后可每隔2天再收獲1次，最多收獲3次。每次收獲細胞后直接進行細胞計數(shù)后按實驗需求鋪于孔板上。

1.3 實驗方法

1.3.1 線粒體膜電位檢測七氟烷對小膠質(zhì)細胞線粒體膜電位的影響，使用JC-1線粒體膜電位測定試劑盒檢測。把BV-2 小膠質(zhì)細胞置于24 孔板中，密度為每孔1×105個細胞。計算并取出實驗需要JC-1染色工作，在細胞經(jīng)過或無七氟烷暴露實驗處理完后吸除培養(yǎng)液，每孔加入JC-1 染色工作液250 μL，并使之充分混勻分布在待測孔中。37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。在此孵育期間，計算并配制適量的JC-1 染色緩沖液，并放置于冰上或4 ℃冰箱。37 ℃孵育結束后，吸除工作液，用JC-1 染色緩沖液避光洗滌3次至干凈。加入DMEM培養(yǎng)液用熒光酶標儀檢測線粒體的熒光強度JC-1單體（激發(fā)光為485 nm；發(fā)射光為535 nm）和聚集體（激發(fā)光為550 nm；發(fā)射光為600 nm）。所有實驗重復3次。

1.3.2 CCK-8 法細胞活力測試收集細胞計數(shù)后把小膠質(zhì)細胞置于24 孔板中，密度為每個孔1 ×105個細胞。分別取100 μL 到96 孔板中培養(yǎng)，每組設3個復孔，培養(yǎng)過夜貼壁，在細胞經(jīng)過或無七氟烷暴露實驗處理完后吸凈細胞上清液并用適量PBS洗滌2 次，CCK-8 和無血清DMEM 培養(yǎng)基按1∶10 體積比混合成檢測液并混勻，取100 μL 加入待測孔中，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱孵育1 h；用酶標儀檢測450 nm波長下的吸光度值并記錄。實驗重復3 次。

1.3.3 免疫熒光實驗原代小鼠小膠質(zhì)細胞接種第2 天后，待細胞在蓋玻片上伸出偽足時，自培養(yǎng)箱中取出，多聚甲醛固定10 min，放置PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3 次，每次5 min，滴加BSA，封閉30 min 后滴加按一定比例配好的Iba1 一抗后放于濕盒內(nèi)4 ℃冰箱孵育過夜，次日洗滌3次，稍甩干后滴加與一抗相應種屬的555 標記二抗覆蓋玻片，避光室溫孵育50 min。DAPI 復染細胞核，避光室溫孵育10 min 后洗滌，用抗熒光淬滅封片劑封片。于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.4 ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測定用酶聯(lián)免疫吸附測定七氟烷激活小膠質(zhì)細胞，在酶標包被板上準確加七氟烷組和對照組組細胞上清液50 μL 后放置于37 ℃中溫育30 min。棄去液體，每孔加滿洗滌液，搖晃洗滌30 s 后棄去，重復5 次，拍干。每孔加入酶標試劑50 μL，后溫育、洗滌。每孔加入顯色液37 ℃避光顯色15 min，加終止液終止反應。在酶標儀用450 nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。所有實驗重復3 次。

1.3.5 透射電子顯微鏡將小膠質(zhì)細胞暴露或不暴露在七氟烷中，處理后用PBS 洗滌細胞兩次，迅速加電鏡固定液用細胞刮輕輕刮下細胞收集到離心管內(nèi)，離心收集細胞要肉眼可見細胞沉淀芝麻至綠豆大小，棄固定液后加新的電鏡固定液室溫固定2 h，再轉移至4℃保存，直至送去透射電鏡顯微鏡拍攝。

1.4 統(tǒng)計學方法應用GraphPad Prism8.0 軟件，實驗數(shù)據(jù)用獨立樣本t檢驗比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義

2 結果

2.1 BV-2 小膠質(zhì)細胞細胞活力及細胞內(nèi)線粒體膜電位比較CCK-8 法檢測細胞活力，七氟烷組與對照組相比較細胞活力并無明顯下降（圖1），差異無統(tǒng)計學意義（n= 3，P= 0.891 3）。用JC-1 試劑盒檢測BV-2 小膠質(zhì)細胞線粒體膜電位時，七氟烷組檢測發(fā)現(xiàn)紅光比例較對照組少，細胞的膜電位相對對照組細胞而言有明顯下降（圖1），差異有統(tǒng)計學意義（n=3，P=0.001 0）。

2.2 BV-2 小膠質(zhì)細胞炎癥因子IL-6 分泌情況比較小膠質(zhì)細胞激活時分泌炎癥因子如IL-6 增多，酶聯(lián)免疫吸附測定炎癥因子IL-6 實驗顯示，七氟烷組BV-2 小膠質(zhì)分泌的IL-6 水平比對照組上升（圖1），差異有統(tǒng)計學意義（n=3，P=0.024 3）。

2.3 原代小鼠小膠質(zhì)細胞鑒定免疫熒光染色對原代小鼠小膠質(zhì)細胞鑒定見圖2，DAPI 染細胞核呈現(xiàn)紫色，Iba1 標記的小膠質(zhì)細胞呈紅色。

2.4 原代小鼠小膠質(zhì)細胞細胞活力及細胞內(nèi)線粒體膜電位比較CCK-8 法檢測細胞活力，加七氟烷組與對照組相比較細胞活力并無明顯下降（n=3，P=0.185 2，圖3A）。用JC-1 檢測BV-2 小膠質(zhì)細胞線粒體膜電位時，把BV-2 小膠質(zhì)細胞暴露在1.3 MAC（2.6% ～2.7%）的七氟烷中4 h，結果顯示在1.3 MAC（2.6%～2.7%）七氟烷的濃度暴露4 h 發(fā)現(xiàn)紅光比例較對照組少，細胞的膜電位相對對照組細胞明顯下降（圖3B），差異有統(tǒng)計學意義（n= 3，P=0.040 9）。

2.5 原代小鼠小膠質(zhì)細胞炎癥因子IL-6 分泌情況比較小膠質(zhì)細胞激活時分泌炎癥因子如IL-6水平上升，酶聯(lián)免疫吸附測定炎癥因子IL-6 實驗表示，七氟烷組原代小鼠小膠質(zhì)分泌的IL-6 水平較對照組上升（圖4），差異有統(tǒng)計學意義（n=3，P=0.046 3）。

2.6 BV-2 小膠質(zhì)細胞受損線粒體及自噬小體數(shù)量比較在電鏡下觀察對照組及七氟烷組BV-2小膠質(zhì)細胞（圖5A），對照組細胞膜結構完整，并見較多偽足與突起，細胞核呈卵圓形，核膜清晰；少量線粒體輕微腫脹，自噬小體數(shù)量較多。七氟烷暴露組細胞整體呈重度水腫，細胞膜邊緣局部小面積破損，膜周圍可見少量微絨毛水腫，細胞核呈不規(guī)則形，局部輕微凹陷，核膜模糊；線粒體數(shù)量豐富，大部分呈明顯腫脹，部分線粒體膜破損、嵴消失；自噬小體數(shù)量較多。七氟烷組BV-2 小膠質(zhì)細胞與對照組對比，單個細胞內(nèi)受損的線粒體數(shù)量增加（n= 3，P= 0.002 6，圖5B），單個細胞內(nèi)自噬小體數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計學意義（n= 3，P=0.022 7，圖5C）。

圖1 JC-1 檢測細胞內(nèi)線粒體膜電位，ELISA 檢測炎癥因子IL-6 分泌水平。Fig.1 JC-1 detects the intracellular mitochondrial membrane potential，and the ELISA detects level of inflammatory factor IL6

圖2 原代小鼠小膠質(zhì)細胞免疫熒光染色鑒定Fig.2 Immunofluorescence staining identification of primary mouse microglial cells

2.7 原代小鼠小膠質(zhì)細胞受損線粒體及自噬小體數(shù)量比較在電鏡下觀察對照組及七氟烷組原代小鼠小膠質(zhì)細胞，七氟烷組BV-2 小膠質(zhì)細胞中，單個細胞內(nèi)受損的線粒體數(shù)量有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學意義（n= 3，P= 0.666 1，圖6A），單個細胞內(nèi)自噬小體數(shù)量減少差異有統(tǒng)計學意義（n=3，P=0.031 2，圖6B）。

2.8 加入線粒體自噬誘導劑魚藤酮后原代小鼠小膠質(zhì)細胞的炎癥因子分泌情況比較酶聯(lián)免疫吸附測定炎癥因子IL-6實驗表示，在分別給原代小鼠小膠質(zhì)細胞對照組和七氟烷組加入線粒體自噬誘導劑魚藤酮（1 μmol/L）處理24 h后，魚藤酮-七氟烷組小膠質(zhì)細胞分泌的IL-6 水平與魚藤酮-對照組小膠質(zhì)細胞比較（圖7），差異無統(tǒng)計學意義（n=3，P=0.912 6）。

圖3 原代小鼠小膠質(zhì)細胞活力及細胞內(nèi)線粒體膜電位Fig.3 Cell viability and mitochondrial membrane potential of primary mouse microglia

3 討論

圖4 ELISA 檢測原代小鼠小膠質(zhì)細胞炎癥因子IL-6 分泌水平Fig.4 ELISA for detecting the level of inflammatory factor IL-6 in primary mouse microglia

目前臨床上七氟烷適用于各種年齡、各部位的大小手術，在臨床上使用七氟烷的濃度范圍為1 ～1.5 MAC。既往研究顯示，使用七氟烷多次麻醉可導致新生幼鼠廣泛性神經(jīng)細胞凋亡影響中樞可塑性及神經(jīng)遞質(zhì)，損傷幼鼠的學習記憶能力［24-25］；大腦中IL-6 等炎癥因子的水平增高，顱內(nèi)炎癥的產(chǎn)生對認知功能產(chǎn)生損害［26］，而這可能與小膠質(zhì)細胞被七氟烷激活，分泌大量如IL-6 等炎癥因子［27］有極大關系；有研究表明，七氟烷處理小膠質(zhì)細胞降低炎癥因子的產(chǎn)生，降低了小膠質(zhì)細胞的活化［10］。為探討臨床相關濃度的吸入麻醉藥七氟烷對小鼠來源的BV-2 細胞系和原代小鼠小膠質(zhì)細胞活化的作用。在本研究中根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)七氟烷在臨床、動物以及細胞使用的濃度多為1 MAC到2 MAC 之間且結合臨床上常用的七氟烷濃度即1.3 MAC，采用小膠質(zhì)細胞在1.3 MAC（2.6%～2.7%）的七氟烷濃度中暴露4 h，觀察小膠質(zhì)細胞的活化。本研究中，暴露在七氟烷中的小膠質(zhì)細胞明顯出現(xiàn)IL-6 等炎癥因子的分泌增多，即七氟烷激活小膠質(zhì)細胞。膠質(zhì)細胞是大腦中很重要的一類細胞，正常情況下對大腦有保護作用，但過度激活的小膠質(zhì)細胞則會引起中樞炎癥［28］。在本實驗中，七氟烷激活小膠質(zhì)細胞可能導致顱內(nèi)神經(jīng)炎癥的發(fā)生［21，26］。

圖5 電鏡下觀察兩組BV-2 小膠質(zhì)細胞內(nèi)部結構Fig.5 Internal structures of two groups of BV-2 microglia were observed with electron microscopy

線粒體是是細胞進行有氧呼吸產(chǎn)生ATP 為細胞提供能量的場所，膜電位是線粒體合成ATP 的動力，膜電位下降導致細胞不能合成足夠的ATP而無法完成正常必要的生命活動［29］。本研究結果顯示，在1.3 MAC（2.6% ～2.7%）的七氟烷濃度中暴露4 h，原代小鼠小膠質(zhì)細胞或者BV2 小膠質(zhì)細胞系的細胞活力維持不變，線粒體膜電位下降，提示七氟烷損傷小膠質(zhì)細胞的線粒體。

圖6 電鏡下觀察兩組原代小鼠小膠質(zhì)細胞內(nèi)部結構Fig.6 The internal structure of two groups of primary mouse microglia cells was observed under electron microscope

圖7 ELISA 檢測加入魚藤酮后原代小鼠小膠質(zhì)細胞炎癥因子IL-6 分泌水平Fig.7 ELISA for detecting the level of inflammatory factor IL-6 in primary mouse microglia treated with rotenone

線粒體自噬是細胞自噬的一種，也是線粒體質(zhì)量控制的重要機制，其可選擇性地清除受損或功能不完整的線粒體［30-31］。研究表明，線粒體自噬在線粒體質(zhì)量控制中起著重要的作用［31］，對順鉑相關神經(jīng)毒性具有保護作用［32］。自噬可以分為三大步驟，雙層分隔膜的形成，自噬體的延伸過程，自噬溶酶體的形成與裂解階段。通過電鏡能從形態(tài)學的角度辨別出自噬小體以及受損的線粒體。在本實驗中通過電鏡觀察細胞內(nèi)結果，原代小鼠小膠質(zhì)細胞或者BV2 小膠質(zhì)細胞系中七氟烷組與對照組相比，七氟烷組小膠質(zhì)細胞中損傷的線粒體數(shù)量比較多，七氟烷組小膠質(zhì)細胞中自噬小體的數(shù)量明顯減少，即在暴露在七氟烷的小膠質(zhì)細胞對損傷的線粒體清除能力不足，過往的研究發(fā)現(xiàn)受損的線粒體大量增多，除了對細胞供能產(chǎn)生影響還會讓ROS 積累損傷細胞使小膠質(zhì)細胞激活［33-34］，抑制ROS 信號防止小膠質(zhì)細胞激活及炎癥產(chǎn)生［34］，提示七氟烷使線粒體自噬過程受到抑制，自噬小體的減少，小膠質(zhì)細胞被激活分泌IL-6 增加，促進神經(jīng)毒性和神經(jīng)退行性疾?。?5］。

魚藤酮作為線粒體自噬誘導劑，在CHU等［36］的研究中誘導原代皮層神經(jīng)元和SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤細胞中線粒體自噬的增加；在THANGARAJ 等［15］研究中，魚藤酮在小膠質(zhì)細胞也引起線粒體自噬的增多。本研究根據(jù)THANGARAJ等［15］研究中的魚藤酮劑量以及作用時長作為參考處理小膠質(zhì)細胞，加入線粒體自噬激動劑魚藤酮后，魚藤酮-七氟烷組與魚藤酮-對照組小膠質(zhì)細胞分泌的炎癥因子IL-6 水平無明顯差別，即線粒體自噬誘導劑抑制了七氟烷對小膠質(zhì)的激活作用，結合上文結果更能反映自噬小體的減少與小膠質(zhì)細胞的激活有關。

綜上，由已有的文獻資料及本研究結果可推斷小膠質(zhì)暴露在1.3 MAC（2.6% ～2.7%）即臨床使用濃度的七氟烷中，線粒體自噬途徑被抑制，小膠質(zhì)細胞激活。本研究仍有不足，未能進一步探討七氟烷如何使小膠質(zhì)細胞的線粒體損傷從而激活小膠質(zhì)細胞的即線粒體自噬引起小膠質(zhì)細胞激活的具體通路，且本文未能明確七氟烷抑制線粒體自噬過程的哪一具體環(huán)節(jié)，擬下一步在進行更深入的體外實驗進行探討。