奶牛殼聚糖乳頭保護(hù)膜藥浴劑的制備及臨床應(yīng)用效果研究

姜鴻瑞，姜 惠，梁煥結(jié)，周靜鵬，韓紫音，毛永江，冀德君，楊章平，張慧敏

(揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

奶牛乳房炎是奶牛業(yè)危害最大，也是最常見(jiàn)的疾病之一，它不僅影響奶牛的健康狀況，而且影響牛奶品質(zhì)，給農(nóng)民和乳制品行業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。病原微生物是誘發(fā)奶牛乳房炎的主要原因之一，迄今為止已發(fā)現(xiàn)了150余種乳房炎致病菌，其中大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、肺炎克雷伯菌、蠟樣芽胞桿菌等比較常見(jiàn)[2-3]。這些致病菌通過(guò)乳頭導(dǎo)管入侵，引起感染。目前，注射抗生素是治療奶牛乳房炎最常用的方法，然而長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)導(dǎo)致奶牛出現(xiàn)抗藥性，最終引起奶牛乳房炎的復(fù)發(fā)和慢性感染[4]。所以有必要對(duì)奶牛乳房進(jìn)行有效的保護(hù)，預(yù)防乳房炎的發(fā)生。

目前最有效的預(yù)防手段是乳頭藥浴劑，常見(jiàn)的主要有過(guò)氧化物類(lèi)、堿類(lèi)、碘與碘化物、含氯化合物、季銨鹽類(lèi)等[5]，它們大都是水溶液型，殺菌力維持時(shí)間短，且長(zhǎng)期使用可對(duì)乳頭皮膚有刺激作用[6]。為此，本試驗(yàn)室前期研制了一種成膜性奶牛乳頭藥浴劑，使用該產(chǎn)品后在乳頭上形成一層保護(hù)膜，可有效防止細(xì)菌侵入，從而預(yù)防乳房炎的發(fā)生[7]，但其主效殺菌成分為聚維酮碘，含量較高，存在牛奶中碘殘留的隱患，對(duì)食品安全有一定影響[8]。

殼聚糖是一種天然聚陽(yáng)離子多糖，無(wú)毒無(wú)害，具有良好的生物相容性和成膜特性，廣泛存在于甲殼類(lèi)動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物中[9]。殼聚糖及其衍生物具有抗感染、抗腫瘤、降血脂、增強(qiáng)免疫功能和抗菌等多種作用[10]。但不同相對(duì)分子質(zhì)量殼聚糖的抑菌效果不盡相同，Asli等[11]發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為(1.3～4.0)×103的殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果要優(yōu)于相對(duì)分子質(zhì)量為(0.4～0.6)×103的殼聚糖。目前，已有報(bào)道表明相對(duì)分子質(zhì)量為(50～90)×103的殼聚糖與鄰氯青霉素復(fù)配使用，可有效地抑制金黃色葡萄球菌[12]?？梢?jiàn)殼聚糖在防治奶牛乳房炎方面具有巨大的應(yīng)用潛力。

因此，本研究首先考察不同相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖對(duì)奶牛乳房炎致病菌的體外抑菌效果，然后以殼聚糖和聚維酮碘為主效消毒成分研制奶牛乳頭保護(hù)膜，通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)及奶牛臨床試驗(yàn)，評(píng)價(jià)殼聚糖乳頭保護(hù)膜對(duì)奶牛隱性乳房炎的預(yù)防效果，該研究以期為擴(kuò)大殼聚糖在奶牛乳房炎防治方面的應(yīng)用，開(kāi)發(fā)殼聚糖相關(guān)的綠色獸藥產(chǎn)品提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌(EscherichiacoliNBRC102203)、綠膿桿菌(PseudomonasaeruginosaDSM 50071)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC12600)、無(wú)乳鏈球菌(StreptococcusagalactiaeATCC 13813)、肺炎克雷伯菌(KlebsiellapneumoniaDSM 30104)、蠟樣芽胞桿菌(BacilluscereusATCC14579)菌株由本試驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

殼聚糖(5～350)×103，脫乙酰度為91%～92%)購(gòu)自浙江金殼藥業(yè)有限公司；成膜性乳頭藥浴劑由本試驗(yàn)室研制，由成膜材料、抑菌成分、保濕成分等組分構(gòu)成；對(duì)照組為市場(chǎng)上常規(guī)藥浴液聚維酮碘，購(gòu)自南京日升昌生物技術(shù)有限公司。

1.3 微生物的培養(yǎng)

將金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌液接種于血平板瓊脂培養(yǎng)基中，其余菌種接種于普通瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.4 殼聚糖水溶液的制備

稱(chēng)取12 g殼聚糖加入98 mL無(wú)菌水、2 mL乙酸，使其溶解，調(diào)節(jié)pH至6.0～7.0。

1.5 殼聚糖保護(hù)膜的制備

乳頭保護(hù)膜的具體配制方法參照文獻(xiàn)[7]并稍作修改，其中殼聚糖的終濃度分別為0.0%、0.5%、1.0%、1.5%，聚維酮碘的終濃度均為4.0%。

1.6 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

在試管中將6種菌液的濃度稀釋至106CFU/mL左右，加入殼聚糖溶液，使殼聚糖溶液的濃度依次稀釋成8%、4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%。37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h，最后一個(gè)無(wú)菌生長(zhǎng)的試管所對(duì)應(yīng)的殼聚糖濃度即MIC。

1.7 抑菌效果評(píng)價(jià)

取150 μL菌液(106CFU/mL)涂布于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，在平皿內(nèi)打孔(直徑為7.58 mm)，每板2個(gè)，將不同相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖或保護(hù)膜溶液分別注入孔內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈直徑。

1.8 乳區(qū)對(duì)比試驗(yàn)

選取處于泌乳期的健康中國(guó)荷斯坦奶牛48頭，每頭奶牛左側(cè)2個(gè)乳區(qū)作為試驗(yàn)組，右側(cè)2個(gè)乳區(qū)作為對(duì)照組。每次擠奶后，分別浸入殼聚糖乳頭保護(hù)膜藥浴劑和普通碘制劑中藥浴3 s，每天3次，試驗(yàn)持續(xù)期為28 d。于試驗(yàn)0、7、14、21、28 d分別進(jìn)行LMT隱性乳房炎檢測(cè)[13]。此外于試驗(yàn)0、14、28 d分乳區(qū)收集奶樣，采用多功能乳成分快速分析儀(MilkoScan FT120，F(xiàn)OSS)進(jìn)行乳脂率、乳蛋白率、乳糖含量、總固體含量和SCC測(cè)定。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 16.0中的單因素ANOVA方差分析模型，分析殼聚糖不同相對(duì)分子質(zhì)量或不同添加量對(duì)6種致病菌抑菌效果的影響；乳區(qū)試驗(yàn)中試驗(yàn)組和對(duì)照組間乳成分、SCC和SCS的差異用t檢驗(yàn)法進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同相對(duì)分子質(zhì)量殼聚糖的抑菌活性

MIC試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。不同相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖對(duì)6種乳房炎致病菌均有抑制效果，其中50×103殼聚糖針對(duì)金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌的MIC最低，為0.25%，針對(duì)其余4種致病菌的MIC為0.50%，較其他相對(duì)分子質(zhì)量殼聚糖的MIC低。5×103和350×103的殼聚糖MIC范圍在4%～8%，顯著高于其他相對(duì)分子質(zhì)量殼聚糖的MIC。而150×103的殼聚糖MIC范圍在0.50%～1.00%之間，略高于50×103殼聚糖的MIC。

將不同相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，由表2可以看出5×103的殼聚糖對(duì)6種致病菌均無(wú)抑制效果，50×103、150×103和350×103的殼聚糖對(duì)6種致病菌均有不同程度的抑制作用。三者均對(duì)大腸桿菌的抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)肺炎克雷伯菌的抑菌作用最弱。方差分析表明：殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)6種致病菌的抑菌效果影響極顯著(P<0.01)，其中50×103殼聚糖對(duì)綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、蠟樣芽胞桿菌的抑菌圈直徑要顯著大于150×103和350×103的殼聚糖，對(duì)大腸桿菌和無(wú)乳鏈球菌的抑菌效果要顯著高于350×103的殼聚糖(P<0.05)。結(jié)合MIC和抑菌效果試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為5×103的殼聚糖對(duì)奶牛乳房炎常見(jiàn)致病菌具有較好的抑制效果，將其應(yīng)用于下一步的殼聚糖保護(hù)膜試驗(yàn)中。

注：同行數(shù)據(jù)上標(biāo)字母相同表示差異不顯著，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:The same letter superscripts in the same row mean insignificant difference, different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same below.

2.2 殼聚糖乳頭保護(hù)膜藥浴劑的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，不同殼聚糖添加量的保護(hù)膜對(duì)6種致病菌均有不同程度的抑制作用，0.50% 殼聚糖添加量的保護(hù)膜對(duì)肺炎克雷伯菌的抑菌作用最強(qiáng)，1.00%和1.50%添加量的保護(hù)膜則對(duì)蠟樣芽胞桿菌的抑菌作用最強(qiáng)。無(wú)殼聚糖添加組對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌的抑菌效果顯著低于1.00%和1.50%添加組(P<0.05)；1.00%和1.50%添加組對(duì)6種致病菌的抑制效果無(wú)顯著差異(P>0.05)。因此，可采用1.00%殼聚糖添加量的乳頭保護(hù)膜藥浴劑開(kāi)展臨床試驗(yàn)。

表3 不同殼聚糖添加量的乳頭保護(hù)膜對(duì)6種致病菌的抑菌效果Table 3 The antibacterial effect of teat dips with different chitosans content mm

2.3 隱性乳房炎的發(fā)病情況

由表4可知，對(duì)照組可疑及陽(yáng)性乳區(qū)數(shù)量雖在7 d時(shí)出現(xiàn)了下降，但隨后一直上升，最后由試驗(yàn)前的6個(gè)增至14個(gè)，占總?cè)閰^(qū)數(shù)的14.58%。試驗(yàn)組的可疑及陽(yáng)性乳區(qū)在7 d和21 d時(shí)出現(xiàn)了下降，但最后由試驗(yàn)前的8個(gè)增至9個(gè)，占總數(shù)的9.38%，增幅遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組。與對(duì)照組聚維酮碘藥浴劑相比，試驗(yàn)組殼聚糖乳頭保護(hù)膜可有效地預(yù)防隱性乳房炎。

2.4 SCC及SCS變化情況

試驗(yàn)前后牛奶中的體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。0、14、28 d時(shí)，對(duì)照組和試驗(yàn)組之間的SCC及SCS均無(wú)顯著差異(P>0.05)。從不同時(shí)間段來(lái)看，對(duì)照組3個(gè)時(shí)間段的SCC變化不顯著，而試驗(yàn)組14 d的SCC顯著低于0 d(P<0.05)；14 d和28 d對(duì)照組和試驗(yàn)組的SCS均顯著低于0 d(P<0.05)。結(jié)果表明殼聚糖乳頭保護(hù)膜藥浴劑能很好的降低乳中的體細(xì)胞數(shù)。

表4 LMT檢測(cè)結(jié)果Table 4 The result of LMT test

表5 SCC及SCS檢測(cè)結(jié)果Table 5 The result of SCC and SCS

注：同行數(shù)據(jù)上標(biāo)*表示差異顯著(P<0.05)；同列數(shù)據(jù)上標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: In the same row, values with * mean significant difference (P<0.05). In the same column, values with the same or no letter superscripts mean insignificant difference (P>0.05), while different lowercase superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.5 乳成分變化情況

乳成分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6，0、14、28 d時(shí)，對(duì)照組和試驗(yàn)組之間的乳成分指標(biāo)均差異不顯著(P>0.05),表明殼聚糖乳頭保護(hù)膜藥浴劑對(duì)乳品質(zhì)無(wú)顯著影響。

3 討 論

乳頭藥浴劑是一種預(yù)防乳房炎的有效措施。擠奶后乳頭迅速浸泡藥浴劑，可有效殺死病原菌，從而預(yù)防乳房炎的發(fā)生。目前常用的藥浴劑大都含有高劑量的碘，它對(duì)乳頭皮膚有一定的刺激性，且絡(luò)合碘中所用的表面活性劑長(zhǎng)期使用還存在一定的毒性[14]。因此后藥浴液在具有足夠殺菌力的同時(shí)，要求碘的含量要低。殼聚糖是一種可降解的生物大分子，它無(wú)毒無(wú)害，且具有良好的抗菌性能，已廣泛地應(yīng)用在食品、藥品及飼料等行業(yè)中。此外，殼聚糖還具有良好的成膜特性[15]，將其引入成膜性乳頭藥浴劑中，不僅可以提高殺菌效果，降低碘的含量，同時(shí)又可以促進(jìn)膜的形成，改善成膜性藥浴劑在乳頭上出現(xiàn)的“下滴現(xiàn)象”。

表6 乳成分檢測(cè)結(jié)果Table 6 The result of milk composition determination %

許多研究表明，殼聚糖的抑菌效果與相對(duì)分子質(zhì)量的大小有關(guān)，低相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，吸附細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的陰離子，發(fā)生絮凝作用，干擾細(xì)胞新陳代謝進(jìn)而殺死細(xì)菌，而高相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖可吸附在細(xì)胞表明，形成一層高分子膜，阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸從而達(dá)到殺菌作用[16-17]。由于不同細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的不同，所以不同相對(duì)分子質(zhì)量殼聚糖對(duì)細(xì)菌的抑制程度也不盡相同。MIC試驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)分子質(zhì)量為5×103和350×103的殼聚糖對(duì)6種乳房炎致病菌的抑制效果不明顯。而50×103的殼聚糖對(duì)6種致病菌的抑制效果較好，它對(duì)乳房炎主要致病菌金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌的MIC為0.25%，而隨著相對(duì)分子質(zhì)量的上升，殼聚糖對(duì)6種致病菌的抑制效果又逐漸下降。該試驗(yàn)結(jié)果與胡瑛等[18]的研究結(jié)果相一致：隨著相對(duì)分子質(zhì)量的升高，殼聚糖對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的抑菌活性先升高后降低。抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果顯示，50×103殼聚糖對(duì)奶牛乳房炎常見(jiàn)致病菌具有較好的抑制效果，而5×103的殼聚糖對(duì)6種致病菌沒(méi)有抑制效果，該研究結(jié)果與宋獻(xiàn)周和沈月新[16]報(bào)道一致，相對(duì)分子質(zhì)量小于5×103的殼聚糖不僅對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌沒(méi)有抑菌作用，反而能促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)。分析原因可能是殼聚糖小分子可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，不僅不干擾細(xì)菌的新陳代謝，反而作為一種多糖物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)增殖。

將殼聚糖加入至試驗(yàn)室前期研發(fā)的成膜性乳頭藥浴劑中，通過(guò)抑菌圈試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加1%相對(duì)分子質(zhì)量為50×103殼聚糖的藥浴劑對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌的抑菌圈要顯著大于未添加殼聚糖的對(duì)照組。體外抑菌試驗(yàn)顯示乳頭藥浴劑中加入殼聚糖可有效的提升保護(hù)膜的抑菌效果。臨床試驗(yàn)采用的是乳區(qū)對(duì)比試驗(yàn)，將同一頭牛的左右乳區(qū)分別浸入殼聚糖乳頭保護(hù)膜藥浴劑和聚維酮碘藥浴劑，降低了奶牛個(gè)體差異對(duì)試驗(yàn)的影響，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確。試驗(yàn)28 d后，試驗(yàn)組和對(duì)照組隱性乳房炎的發(fā)病率分別為9.38%和14.58%，可見(jiàn)試驗(yàn)組的隱性乳房炎發(fā)病率明顯低于對(duì)照組。

SCC是衡量奶牛感染乳房炎嚴(yán)重程度的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，但由于其偏態(tài)分布，在科學(xué)研究和生產(chǎn)中常將其轉(zhuǎn)化為屬于典型正態(tài)分布的SCS[19]。目前，大多數(shù)國(guó)家均將它們作為奶牛乳房炎抗性的一個(gè)主要性狀加以追蹤[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)28 d后，試驗(yàn)組的SCC從130.01×103/ mL下降至73.34×103/mL，SCS從1.28下降至0.85，而對(duì)照組的SCC降低不顯著。由此可看出，與對(duì)照組10%的聚維酮碘藥浴劑相比，試驗(yàn)組的殼聚糖乳頭保護(hù)膜藥浴劑雖然僅含有4%的聚維酮碘，但可有效地預(yù)防隱性乳房炎。與普通水溶性藥浴劑相比，成膜性乳頭藥浴劑預(yù)防隱性乳房炎的效果更佳，因?yàn)樗稍谌轭^表面形成一種長(zhǎng)效抗菌保護(hù)膜，縮短乳頭管的開(kāi)放時(shí)間，從而有效降低致病菌入侵的幾率，同時(shí)在兩次擠奶間隙保護(hù)乳頭，防止墊料、飼料等環(huán)境性致病菌的侵入[21]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明殼聚糖乳頭保護(hù)膜藥浴劑對(duì)防治奶牛隱性乳房炎效果明顯，且對(duì)乳品質(zhì)無(wú)顯著影響，是一種操作簡(jiǎn)易、綠色、安全有效的藥浴劑，該研究不僅為新型防治奶牛乳房炎獸用藥浴劑的研發(fā)提供了思路，而且對(duì)推動(dòng)奶牛健康養(yǎng)殖具有重要的意義。