棉花秸稈纖維素酶水解的神經(jīng)網(wǎng)絡模擬優(yōu)化及混合酶水解的協(xié)同作用

龔曉武，李琴，呼肖娜，李勇，周娜

(石河子大學化學化工學院/新疆兵團化工綠色過程重點實驗室,新疆 石河子 832003)

新疆棉花秸稈資源十分豐富,然而大部分棉稈被焚燒或退耕還田,利用效率較低[1-2]。棉稈等木質纖維素類生物質主要由纖維素、半纖維素和木質素組成,其中纖維素在纖維素酶中水解可以生成葡萄糖,進一步發(fā)酵可生成乙醇等化學品[3]。由于生物質結構復雜,纖維素被半纖維素、木質素包裹和纏繞,所以直接對其進行酶解反應的糖產率較低。為了提高纖維素的水解效率,需要通過預處理方法,打破包裹纖維素的屏障[3-6]。研究[7-9]表明,酸法預處理能有效打破半纖維素分子中的醚鍵,破壞木質纖維素類生物質的緊密結構,使纖維素表面結構暴露,與酶的接觸面積增大,促進酶解反應的進行。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(Artificial Neural Network,ANN)是模擬生物神經(jīng)網(wǎng)絡功能和結構的數(shù)學模型,可用于非線性、復雜過程的模擬與優(yōu)化。已有研究[2,10-12]將人工神經(jīng)網(wǎng)絡用于生物質的預處理過程,而將其用于優(yōu)化酶解過程的研究較少,因此，本文采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡對稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解的過程進行模擬與優(yōu)化,對稀H2SO4處理棉稈在混合酶(纖維素酶、木聚糖酶)中的水解進行研究,期望提高棉稈的糖化效率,為生物質高效酶解工藝的優(yōu)化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

棉稈來自新疆石河子市郊區(qū)農田,經(jīng)日照曬干后,剪切、粉碎并過篩,取2 mm粒徑的棉稈備用；纖維素酶和木聚糖酶購于寧夏和氏璧生物技術有限公司,葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等標準樣品為色譜純,其他化學試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 棉稈的稀H2SO4預處理

稱取4 g棉稈放入反應釜中,再加入40 mL不同濃度(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mol/L)稀H2SO4溶液,在150 ℃預處理90 min后水洗至中性,烘干后備用。

1.2.2 稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中的水解

稱取2 g經(jīng)稀H2SO4預處理后的棉稈,加入不同濃度纖維素酶溶液(0、150、300、450和600 FPU),并用CH3COOH—CH3COONa緩沖溶液調節(jié)溶液pH至4.0、4.5、5.0、5.5和6.0,將其置于恒溫水浴搖床(溫度為35、40、45、50和55 ℃)中在轉速150 r/min下反應72 h,分別在0、8、12、24、36、48、72 h時取樣,測定其還原糖產率。

1.2.3 稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶/木聚糖酶中的水解

稱取2 g稀H2SO4預處理后的棉稈,加入一定量的纖維素酶溶液(150、300和450 FPU)，并添加不同量的木聚糖酶溶液(0、25、75、125、150和200 IU),調節(jié)溶液pH為5.0,在45 ℃的恒溫水浴搖床中水解48 h,取樣,測定其還原糖產率。

1.3 分析方法

采用美國國家可再生能源實驗室(NREL)提出的二步酸水解法[13]測定棉稈中各組分的含量;利用HPLC測定棉稈酶解液中還原糖的濃度。

1.4 實驗設計

1.4.1 響應曲面實驗設計

基于稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解產糖的單因素實驗,采用Box-Behnken中心組合設計四因素三水平實驗,研究酶解溫度、纖維素酶用量、pH和水解時間對稀H2SO4處理棉稈酶解產糖的影響,每組實驗平行2次,取平均值。

1.4.2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型的構建

以響應曲面實驗獲得的數(shù)據(jù)為源數(shù)據(jù),選用酶解溫度、纖維素酶用量、pH和水解時間4個因素為輸入?yún)?shù),酶解所得的還原糖產率為輸出參數(shù),利用Matlab軟件建立稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解過程的神經(jīng)網(wǎng)絡模型,通過多次訓練得到當模型隱含層的神經(jīng)元個數(shù)為5時還原糖產率的網(wǎng)絡輸出值與實驗值之間的誤差最小,從而建立本文研究的神經(jīng)網(wǎng)絡模型結構為4-5-1,如圖1所示。稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解過程模型的有效性由網(wǎng)絡模型的均方誤差(mean square error,MSE)和相關系數(shù)(R)確定[14]。

圖1 稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解的神經(jīng)網(wǎng)絡模型圖

2 結果與分析

2.1 棉稈的三組分分析

棉稈原料、稀H2SO4處理棉稈及酶解后棉稈的組分如表1所示。

表1 三種棉稈物料的組分

注：稀硫酸預處理的條件為150 ℃、90 min、0.3 mol/L H2SO4和10%固含量，酶解條件為45.32 ℃、434.23 FPU纖維素酶、pH 4.98和68.37 h。

由表1可知:

(1)棉稈經(jīng)H2SO4處理后,其纖維素含量和木質素含量分別從38.49%、24.15%增至49.21%、25.32%,但半纖維素含量由27.21%降至15.79%。表明稀H2SO4可以有效溶解棉稈中的半纖維素,對纖維素和木質素的影響則較小,這與WANG等[3]研究結果一致。

(2)稀H2SO4處理的棉稈在纖維素酶中水解后,其纖維素含量降至23.74%,木質素含量增至45.17%。這是由于棉稈中部分纖維素在纖維素酶溶液中水解后,纖維素含量的降低而引起木質素的含量相對升高[9]。

2.2 稀H2SO4預處理對棉稈酶解產糖的影響

結果(圖2)顯示:隨著棉稈預處理時稀H2SO4濃度的增加,還原糖產率呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢,當稀H2SO4濃度為0.3 mol/L時,棉稈的還原糖產率達到最大,為65.73%;此后,隨著稀H2SO4濃度繼續(xù)增加,酶解后的糖產率顯著下降,這是由于預處理條件增強使棉稈中纖維素發(fā)生降解而引起[8]。結合本課題組前期研究結果[15],后續(xù)酶解實驗中采用棉稈物料的預處理條件為反應溫度150 ℃、時間90 min和H2SO4濃度0.3 mol/L。

圖2 稀H2SO4濃度對棉稈酶解產糖的影響

2.3 稀H2SO4預處理棉稈酶解產糖的響應曲面實驗

在單因素實驗基礎上采用Box-Behnken設計實驗,研究酶解溫度、纖維素酶用量、pH和水解時間對稀H2SO4處理棉稈產糖的影響,四因素三水平的實驗設計如表2所示,共計29組實驗,實驗數(shù)據(jù)如表3所示。

表2 棉稈在纖維素酶中水解的實驗參數(shù)和水平

表3 棉稈在纖維素酶中水解的Box-Behnken實驗設計及其響應值

2.4 人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型的建立、訓練與優(yōu)化

基于表3中響應曲面實驗數(shù)據(jù),采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡構建稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中酶解產糖的神經(jīng)網(wǎng)絡模型,表3中50%的數(shù)據(jù)用于網(wǎng)絡模型的訓練,25%用于測試,25%用于驗證。通過多次訓練網(wǎng)絡模型,獲得最優(yōu)的神經(jīng)網(wǎng)絡模型(4-5-1),并得到網(wǎng)絡訓練、測試和驗證的MSE和R(表4)。

表4 棉稈在纖維素酶中水解的神經(jīng)網(wǎng)絡模型的MSE和R值

由表4可知,棉稈在纖維素酶中酶解糖化的神經(jīng)網(wǎng)絡模型的MSE較小,R趨向于1。這表明模型的預測準確性較好,可以用于預測稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中酶解的還原糖產率。

表5是優(yōu)化后神經(jīng)網(wǎng)絡模型的權重和偏差?；诒?中棉稈在纖維素酶中水解的數(shù)據(jù),利用表5中網(wǎng)絡模型的連接參數(shù),采用文獻[14,16]中方法對棉稈酶解的還原糖產率進行再次預測，同時采用文獻[10]中方法計算本文研究4種輸入?yún)?shù)對棉稈酶解產糖的貢獻率,結果見表6。

表5 棉稈在纖維素酶中水解的神經(jīng)網(wǎng)絡模型的優(yōu)化參數(shù)(權值和閾值)

表6 酶解參數(shù)對棉稈酶解產糖的貢獻率

由表6可知：酶解溫度、纖維素酶用量、pH和水解時間對稀H2SO4處理棉稈酶解產糖的貢獻率不同,其中,纖維素酶用量對H2SO4處理棉稈酶解產糖的影響最大,且貢獻率順序為纖維素酶用量>酶解溫度>水解時間>pH。

圖3是棉稈在纖維素酶中水解得到的還原糖產率的實驗值與模型預測值的線性回歸圖。通過線性分析可知:R為0.9246,接近1,表明網(wǎng)絡模型可用于預測稀H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解的還原糖產率。利用神經(jīng)網(wǎng)絡模型對棉稈在纖維素酶中的水解過程進行優(yōu)化,得到酶解的最優(yōu)條件如下:當酶解溫度為45.32 ℃,纖維素酶用量為434.23 FPU,pH為4.98,水解時間為68.37 h時,酶解得到的還原糖產率最大,為72.93%。

圖3 棉稈酶解的還原糖產量的實驗值與模型預測值

2.5 木聚糖酶添加量對棉稈在纖維素酶中水解產糖的影響

為了進一步提高稀H2SO4處理棉稈的產糖率,將木聚糖酶添加到不同濃度的纖維素酶溶液中,初步探究木聚糖酶添加量對棉稈在纖維素酶中水解產糖的影響,結果見圖4。

圖4 棉稈在纖維素酶/木聚糖酶中水解的還原糖產率

由圖4可知：

(1)當固定纖維素酶用量為150、300、450 FPU時,稀H2SO4處理棉稈的產糖率隨木聚糖酶添加量增大呈先增加后降低的趨勢,且當木聚糖酶添加量為125 IU時,稀H2SO4處理棉稈的還原糖產率達到最大,分別為92.42%、70.06%和71.82%。

(2)當木聚糖酶添加量大于125 IU和纖維素酶用量為300、450 FPU時,還原糖產率均低于纖維素酶用量為150 FPU的產率,可知當木聚糖酶含量增加到一定程度時,增大纖維素酶用量對稀H2SO4處理棉稈的還原糖產率影響不大。這可能是由于酶溶液中纖維素酶濃度較高,不利于木聚糖酶吸附于半纖維素表面,導致半纖維素的降解減少,還原糖產率降低。

(3)當纖維素酶用量為150 FPU、木聚糖酶的添加量為125 IU時,稀H2SO4處理棉稈的還原糖產率最高,可達92.42%,顯著高于最優(yōu)條件下棉稈在纖維素酶中酶解的還原糖產率(72.93%)。

3 討論

新疆棉稈資源豐富,將其轉化為糖類中間體,有利于棉稈的高值化利用。棉稈等秸稈類物質是木質纖維素類生物質的一種,主要是由纖維素、半纖維素和木質素組成,其中纖維素被半纖維素和木質素包裹和纏繞,若直接進行酶解反應,還原糖產率較低[3-4]。為了提高木質纖維素類生物質中纖維素的水解率,在纖維素酶解之前,需通過預處理打破包裹纖維素的屏障,增加孔隙率,增大纖維素酶與底物的接觸面積[9,15]。

(1)稀酸可以有效破壞半纖維素分子中的醚鍵,使其降解生成可發(fā)酵糖,同時也能破壞棉稈等生物質的緊密結構,使纖維素部分暴露出來,與酶的接觸面積增大,促進酶解反應的進行[7-9]。Narendra Naik DESHAVATH等[8]采用0.2 mol/L H2SO4在121 ℃對高粱秸稈預處理120 min,預處理后高粱秸稈中木聚糖的轉化率高達89%。Ioannis A PAPPAS等[9]研究稀H2SO4預處理對PhalarisaquaticaL.產糖的影響,發(fā)現(xiàn)用2%(w/w)H2SO4在130 ℃對PhalarisaquaticaL.預處理60 min,葡萄糖產率可達85.05%,稀酸預處理后酶解生成葡萄糖的量比未處理時高1.7倍。本文研究采用0.3 mol/L H2SO4在150 ℃對棉稈預處理90 min,與棉稈原料直接酶解產糖相比[15],稀酸預處理后酶解的還原糖產率增大了2.12倍。由此可知,稀H2SO4預處理可以有效提高木質纖維素生物質中糖類的釋放。

(2)棉稈等生物質的水解糖化過程機理非常復雜,受多種因素的綜合影響,其動力學過程是非線性的,采用簡單的模型無法準確模擬和解釋酶解過程[2,14]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡是模擬生物神經(jīng)網(wǎng)絡功能和結構的數(shù)學模型,能較好地用于非線性、復雜的酶解過程的模擬與優(yōu)化[10-12]。Chenwei CHANG等[10]采用神經(jīng)網(wǎng)絡、多元線性回歸和偏最小二乘回歸模擬研究蒸汽爆破預處理對象草(napiergrass)酶解的影響,發(fā)現(xiàn)構建的神經(jīng)網(wǎng)絡模型預測性能最好。本文研究表明,當中間隱含層的神經(jīng)元個數(shù)為5時,還原糖產率的網(wǎng)絡輸出值與實驗值之間的誤差最小,從而建立了H2SO4處理棉稈在纖維素酶中水解的神經(jīng)網(wǎng)絡模型(4-5-1),模型的MSE較小,R趨向于1,表明建立的神經(jīng)網(wǎng)絡模型可用于預測棉稈酶解產糖的過程。

(3)半纖維素中存在的木聚糖成分是纖維素酶對木質纖維素底物水解的一道天然屏障,限制了纖維素酶與纖維素的結合[18],添加木聚糖酶能夠進一步對未去除的半纖維素進行水解,同時釋放出木糖。在木質纖維素類生物質水解過程中,同時添加纖維素酶與木聚糖酶對水解產糖有顯著的協(xié)同作用。Geisa A L GONCALVES等[17]對乙酸預處理過后的甘蔗渣進行酶解研究發(fā)現(xiàn),反應72 h后添加纖維素酶與木聚糖酶的實驗組水解生成還原糖的濃度比只添加纖維素酶的實驗組升高2.30倍。本文研究表明,在纖維素酶中添加木聚糖酶,可將H2SO4處理棉稈的還原糖產率由72.93%提高至92.42%。因此,木聚糖酶輔助纖維素酶酶解,二者之間的協(xié)同作用可使得在減少纖維素酶用量的前提下,添加較少量的木聚糖酶就可以獲得較高的還原糖產率,從而大幅減少纖維素酶用量,降低酶解成本,以及木質纖維素類生物質水解產糖的成本。

4 結論

(1)研究了稀H2SO4預處理對棉稈酶解產糖的影響,當稀H2SO4濃度為0.3 mol/L,反應溫度為150 ℃,反應時間為90 min時,棉稈的還原糖產率達到最大,為65.73%。

(2)建立了稀H2SO4預處理棉稈在纖維素酶中水解產糖的神經(jīng)網(wǎng)絡模型(4-5-1),確定纖維素酶用量是影響稀H2SO4預處理棉稈酶解產糖的主要因素。

(3)向纖維素酶溶液中添加木聚糖酶,可將H2SO4處理棉稈的還原糖產率由在纖維素酶單酶體系中的72.93%增大至92.42%。表明木聚糖酶與纖維素酶有較好的協(xié)同作用,采用混合酶酶解能夠有效提高木質纖維素生物質的水解效率。本文的研究為新疆棉稈的高值化利用奠定基礎。