人類ErbB2轉(zhuǎn)錄因子1基因多態(tài)性與陜西漢族人群胃癌的關(guān)系研究

李曉波，范志剛，李 婷，白素琴，張清雯

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬3201醫(yī)院：1.微生物免疫檢驗(yàn)科分子診斷實(shí)驗(yàn)室； 2.腫瘤內(nèi)科一病區(qū)；3.臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，陜西漢中 723000)

胃癌是臨床常見腫瘤之一，高發(fā)于東亞、西歐及拉丁美洲等地區(qū)，其病死率僅次于肺癌和肝癌，5年生存率僅為10%～15%[1]。我國(guó)胃癌患者人數(shù)約占全球胃癌患者總?cè)藬?shù)的50%，為社會(huì)及家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胃癌是由飲食、環(huán)境和遺傳因素共同決定的多因素復(fù)雜疾病[3]，但具體作用機(jī)制尚未完全明確。1996年，有研究在ErbB2受體型蛋白酪氨酸激酶與蛋白相互作用時(shí)首次發(fā)現(xiàn)了人類ErbB2轉(zhuǎn)錄因子1(TOB1)基因，TOB1蛋白是BTG/TOB家族抗增殖蛋白成員之一，其與細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，TOB1基因表達(dá)差異與胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)[5-7]；且TOB1基因遺傳多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在密切關(guān)系[8]。但在陜西漢族人群胃癌的相關(guān)研究中還未見類似報(bào)道，因此，本文主要研究TOB1基因rs61482741、rs34700818、rs12601477、rs4626 4個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)與陜西漢族人群胃癌的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年10月本院腫瘤外科和腫瘤內(nèi)科經(jīng)病理活檢確診的胃癌患者320例為胃癌組。胃癌臨床診斷及病理分期依據(jù)《WS316-2010胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》[9]。胃癌組患者TNM分期為：0期8例，Ⅰ期97例，Ⅱ期124例，Ⅲ期68例，Ⅳ期23例。選取本院經(jīng)胃鏡檢查及病理活檢排除胃癌的門診患者350例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：同意加入本研究，并簽署知情同意書；均為陜西漢族人群，且無血緣關(guān)系，無異族通婚史。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心腦血管疾病、糖尿病、腫瘤及其他全身性疾病。兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 采集胃癌組和對(duì)照組靜脈全血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，混勻后取200 μL全血待測(cè)；采用血液基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司，DP348 離心柱型)提取DNA，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；加入100 μL pH 8.0 TE DNA緩沖液洗脫DNA，采用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量基因組DNA水平；采用pH 8.0 TE DNA緩沖液調(diào)整DNA終水平至50 ng/μL；置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 兩組一般資料比較

1.2.2候選SNP位點(diǎn)選擇，引物與酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì) 本研究使用https://www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站篩選TOB1基因SNP位點(diǎn)，以中國(guó)漢族人群數(shù)據(jù)庫最小等位基因頻率>0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合相關(guān)研究[9]，選定17號(hào)染色體rs61482741(NM 001243877)、rs34700818(NM 001243877)、rs12601477(NM 001243877)、rs4626(NM 001243877)為本次研究候選SNP位點(diǎn)。采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物；在https://genome.ucsc.edu網(wǎng)站使用In-Silico PCR軟件驗(yàn)證各SNP位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物特異性。PCR擴(kuò)增引物委托上海生工生物科技有限公司合成。在http://watcut.uwaterloo.ca網(wǎng)站使用SNP-RFLP analysis軟件篩選4個(gè)SNP位點(diǎn)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)內(nèi)切酶位點(diǎn)；限制性內(nèi)切酶Eam1104I(rs61482741，貨號(hào)：FD0234)、Csp6I(rs34700818，貨號(hào)：FD0214)、TaiI(rs12601477，貨號(hào)：FD1144)、Alw26I(rs4626，貨號(hào)：FD0034)購(gòu)于Thermo ScientificTM公司。見表2。

1.2.3候選SNP位點(diǎn)基因分型 PCR擴(kuò)增：采用BIO-RAD C1000梯度PCR儀，PCR擴(kuò)增試劑為康為世紀(jì)公司 2×Taq Plus Master Mix (Dye)試劑盒(貨號(hào)：CW2849L)，反應(yīng)體系為2×Taq Plus Master Mix (Dye) 25 μL，正向引物(10 μmol/L)2 μL，反向引物(10 μmol/L)2 μL，模板DNA 1 μL(約50 ng/L)，用雙蒸餾水補(bǔ)足總體積至50 μL。擴(kuò)增程序：預(yù)變性 94 ℃ 2 min；變性94 ℃ 30 s；退火(rs61482741為55 ℃ 30 s,rs34700818和rs2601477為58 ℃ 30 s,rs4624為62 ℃ 30 s)；延伸72 ℃ 30 s 共30個(gè)循環(huán),延伸72 ℃ 2 min,12 ℃ 保存。限制性酶切：4個(gè)SNP位點(diǎn)分別取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL加入對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶[Eam1104I (rs61482741)、Csp6I (rs34700818)、TaiI (rs12601477)、Alw26I (rs4626)] 0.5 μL,10×FastDigest Buffer 1 μL,純水8.5 μL補(bǔ)足總體積至15 μL 酶切體系；37 ℃ 孵育15 min，80 ℃滅活10 min。取酶切后的產(chǎn)物5 μL加入康為世紀(jì)公司6×Loading buffer (CW0610) 1 μL 混合。2.0%瓊脂糖凝膠(EB染料)水平電泳，DNA Marker選用 DL500 DNA Marker試劑盒 (Takara公司，貨號(hào)：3590A)，電壓110 V,30 min后使用BIO-RAD GelDoc XR+ 凝膠成像儀分析結(jié)果。各SNP位點(diǎn)不同RFLP類型片段大小判斷標(biāo)準(zhǔn)見表2。為確認(rèn)分型結(jié)果，隨機(jī)抽取5% 標(biāo)本通過直接測(cè)序法驗(yàn)證基因分型結(jié)果準(zhǔn)確性。

表2 PCR擴(kuò)增引物與限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

注：F為正向引物，R為反向引物。

2 結(jié) 果

2.1TOB1基因候選SNP位點(diǎn)等位基因頻率與胃癌的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)結(jié)果 胃癌組與對(duì)照組TOB1基因4個(gè)候選SNP位點(diǎn)(rs61482741、rs34700818、rs12601477、rs4626)基因分型結(jié)果均符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)，兩組具有群體代表性，可用于病例-對(duì)照研究。TOB1基因內(nèi)含子區(qū)域rs61482741位點(diǎn)G等位基因頻率胃癌組為36.4%，高于對(duì)照組的29.9%，G等位基因攜帶者患胃癌風(fēng)險(xiǎn)是C等位基因的1.42倍(P=0.011,95%CI=1.15～1.78)。外顯子區(qū)域rs4626位點(diǎn)G等位基因頻率胃癌組為50.6%，高于對(duì)照組的43.1%，G等位基因攜帶者患胃癌風(fēng)險(xiǎn)是A等位基因的1.41倍(P=0.006,95%CI=1.16～1.76)。內(nèi)含子區(qū)域rs34700818和rs12601477位點(diǎn)等位基因頻率在胃癌組與對(duì)照組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 TOB1基因候選SNP位點(diǎn)等位基因頻率與胃癌的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)結(jié)果[n(%)]

注：chr17為17號(hào)染色體；P和OR(95%CI)為使用Logistic回歸分析經(jīng)年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史等校正后的數(shù)據(jù)。

2.2TOB1基因候選SNP位點(diǎn)基因型、顯性模式和隱性模式頻率與胃癌的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)結(jié)果 內(nèi)含子區(qū)域rs61482741位點(diǎn)基因型(CC與GG)比較中，胃癌組GG基因型頻率為13.4%，高于對(duì)照組的8.6%，GG基因型攜帶者患胃癌風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的1.91倍(P=0.016,95%CI=1.18～3.23)；在顯性模式(GG+CG與CC)胃癌組與對(duì)照組比較中，GG+CG基因型攜帶者患胃癌風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的1.44倍(P=0.032，95%CI=1.05～1.93)；在隱性模式(GG與CG+CC)胃癌組與對(duì)照組比較中，GG基因型攜帶者患胃癌風(fēng)險(xiǎn)是CG+CC基因型的1.68倍(P=0.043，95%CI=1.03～2.74)。外顯子區(qū)域rs4626位點(diǎn)基因型(GG與AA)比較中，胃癌組GG基因型頻率為25.6%，高于對(duì)照組的18.6%，GG基因型攜帶者患胃癌風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型的1.85倍(P=0.006,95%CI=1.20～2.85)；在顯性模式(GG+AG與AA)胃癌組與對(duì)照組比較中，GG+AG基因型攜帶者患胃癌風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型的1.53倍(P=0.023,95%CI=1.10～2.16)；在隱性模式(GG與AA+AG)胃癌組與對(duì)照組比較中，GG基因型攜帶者患胃癌風(fēng)險(xiǎn)是AA+AG型的1.56倍(P=0.028,95%CI=1.09～2.21)。內(nèi)含子區(qū)域rs34700818和rs12601477位點(diǎn)基因型、顯性模式和隱性模式頻率在胃癌組與對(duì)照組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 TOB1基因候選SNP位點(diǎn)基因型、顯性模式和隱性模式頻率與胃癌的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)結(jié)果[n(%)]

續(xù)表4 TOB1基因候選SNP位點(diǎn)基因型、顯性模式和隱性模式頻率與胃癌的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)結(jié)果[n(%)]

注：P和OR(95%CI)為使用Logistic回歸分析經(jīng)年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史等校正后的數(shù)據(jù)。

2.3TOB1基因候選SNP位點(diǎn)連鎖不平衡分析 TOB1基因4個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因分型數(shù)據(jù)結(jié)合其在17號(hào)染色體上的位置信息，使用Haploview 4.2軟件分析得到4個(gè)SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡關(guān)聯(lián)圖，見圖1。rs61482741、rs34700818和rs12601477位點(diǎn)位于一個(gè)連鎖不平衡區(qū)域，其中rs34700818與rs12601477位點(diǎn)存在高度連鎖關(guān)系(D′=0.91,r2=0.76)，rs61482741與rs34700818位點(diǎn)存在高度連鎖關(guān)系(D′=0.81,r2=0.52)。連鎖分析發(fā)現(xiàn)，rs61482741、rs34700818和rs12601477組成的單倍體GAT型頻率胃癌組為22.7%，低于對(duì)照組的28.9%，GAT單倍體型攜帶者患胃癌風(fēng)險(xiǎn)比其他單倍體型低(P=0.010，OR=0.72，95%CI=0.57～0.92)。單倍體CAT型頻率胃癌組為12.8%，高于對(duì)照組的4.1%，CAT單倍體型攜帶者患胃癌風(fēng)險(xiǎn)比其他單倍體型高(P<0.001，OR=3.44，95%CI=2.19～5.40)。見表5。

注：A為TOB1基因SNP位點(diǎn)連鎖不平衡區(qū)域D′值，rs12601477和rs34700818的D′為0.91，rs12601477和rs61482741的D′為0.64，rs34700818和rs61482741的D′為0.81；B為TOB1基因SNP位點(diǎn)連鎖不平衡區(qū)域r2值，rs12601477和rs34700818的r2為0.76，rs12601477和rs61482741的r2為0.35，rs34700818和rs61482741的r2為0.52。

圖1 TOB1基因候選SNP位點(diǎn)連鎖不平衡關(guān)聯(lián)圖

表5 rs61482741、rs34700818和rs12601477單倍體頻率在兩組中的分布情況比較 (%)

3 討 論

胃癌的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，其具體致病機(jī)制尚不明確，目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。TOB1基因具有抑制細(xì)胞增殖的能力，TOB1蛋白低表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

TOB1基因位于常染色體17q21.3-22上，其編碼的TOB1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為45 000，由345個(gè)氨基酸組成，屬于BTG/TOB蛋白家族[10-11]。在脊椎動(dòng)物中，BTG/TOB蛋白家族包括 BTG1、BTG2/PC3/Tis21、BTG3/ANA、BTG4/PC3B、TOB1/TOB和TOB2，其共用一個(gè)保守的BTG同源氨基末端。研究發(fā)現(xiàn)，BTG區(qū)域包含BoxA和BoxB兩個(gè)區(qū)域，其中BoxA具有抗增殖作用，BoxB是靶分子特異性結(jié)合區(qū)域[12]。TOB1蛋白與人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)基因存在高度相關(guān)性，TOB1蛋白抑制癌基因HER-2的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[12]。KUNDU等[13]的體外細(xì)胞培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，胃癌MKN28和AGS細(xì)胞系TOB1基因過表達(dá)可以激活Smad4及抑制β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。后續(xù)還發(fā)現(xiàn)胃癌MKN28和AGS細(xì)胞系中TOB1基因過表達(dá)能阻滯G1前期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，SEAN等[14]在乳腺癌MCF-7細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)TOB1基因過表達(dá)能阻滯G1～S期，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在MCF-7細(xì)胞中增強(qiáng)TOB1基因表達(dá)時(shí)可見細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P27表達(dá)上調(diào)，同時(shí)，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表達(dá)下調(diào)，在轉(zhuǎn)染shRNA-TOB1細(xì)胞中結(jié)果相反。YU等[15]經(jīng)免疫組織化學(xué)分析了97例胃癌組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)97%的胃癌患者組織中TOB1基因表達(dá)缺失或顯著下降，蛋白印跡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3/4的胃癌細(xì)胞系中存在TOB1蛋白表達(dá)下降，磷酸化TOB1蛋白比例明顯升高。

近年來，越來越多的證據(jù)表明遺傳變異在大多數(shù)疾病中起到關(guān)鍵作用，特別是在腫瘤疾病中[16]。作為常見的突變形式，多個(gè)基因SNP位點(diǎn)在研究中被證明與胃癌相關(guān)[17-18]。WANG等[8]收集了506例胃癌患者和548例健康對(duì)照者標(biāo)本，研究了TOB1基因11個(gè)候選SNP位點(diǎn)與東北漢族胃癌患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者比較，rs12601477、 rs4626、 rs34700818和rs61482741等位點(diǎn)在胃癌患者中存在顯著性差異，并且rs12601477、rs34700818、rs12950561、rs9903822、rs11656976、rs7221352和rs61482741位點(diǎn)在一個(gè)連鎖不平衡區(qū)域，rs4626、rs35220381、rs12649115位點(diǎn)在另一個(gè)連鎖不平衡區(qū)域。本研究在陜西漢族胃癌患者中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，rs12601477、rs34700818、rs61482741位點(diǎn)位于一個(gè)連鎖不平衡區(qū)域，與東北漢族結(jié)果一致，但東北漢族胃癌患者rs12601477和rs34700818位點(diǎn)的D′為0.99，高于陜西漢族的0.91；而變化最顯著的是rs12601477和rs61482741位點(diǎn)，東北漢族胃癌患者D′為0.96,本研究陜西漢族D′下降到0.64。

本研究在等位基因比較中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子區(qū)域rs61482741位點(diǎn)G等位基因頻率胃癌組為36.4%，高于對(duì)照組的29.9%，G等位基因攜帶者患胃癌風(fēng)險(xiǎn)是C等位基因的1.42倍，與WANG等[8]研究結(jié)果一致；在顯性模式(GG+CG與CC)胃癌組與對(duì)照組比較中，GG+CG基因型攜帶者患胃癌風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的1.44倍。在東北漢族人群中，rs61482741位點(diǎn)GG+CG基因型被證明與T3～T4期胃癌風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[8]。外顯子區(qū)域rs4626位點(diǎn)顯性模式(GG+AG與AA)胃癌組與對(duì)照組比較中，GG+AG基因型攜帶者患胃癌風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型的1.53倍。在東北漢族人群的研究中證實(shí)，rs4626位點(diǎn)顯性模式GG+AG基因型與58歲以上人群患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[8]。

4 結(jié) 論

本研究初步驗(yàn)證了人類TOB1基因SNP位點(diǎn)rs61482741和rs4626可能是陜西漢族人群胃癌的易感基因位點(diǎn)，且涉及的多種遺傳模型為后續(xù)研究提供了方向，也為胃癌的早期預(yù)防提供了生物學(xué)標(biāo)志物。