ApoE基因rs429358和rs7412位點基因多態(tài)性與喀什地區(qū)維吾爾族人群尿道結石的關系研究*

張 媛，侯 麗，楊 帆，鄺 輝△

(1.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科，新疆喀什 844000；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，新疆烏魯木齊 830000；3.同濟大學附屬同濟醫(yī)院檢驗科，上海 200333)

尿道結石作為泌尿系統(tǒng)最常見的疾病，其發(fā)病人數逐年遞增[1]。目前，尿道結石診斷主要依靠CT等影像學檢查，缺少相關的實驗室診斷標志物，大多數患者確診時病情已較嚴重。尋找靈敏度、特異度高的診斷標志物，用于早期診斷，對尿道結石的治療及預防具有重要意義[2]。尿道結石的發(fā)病除了與生活方式、飲食習慣有關外，還與遺傳因素密切相關。有研究報道，尿道結石的發(fā)病呈現(xiàn)一定的地域和種族差異，喀什地區(qū)尿道結石發(fā)病率較高，考慮與該地區(qū)地理位置和維吾爾族人群的種族特異性有關[3]。載脂蛋白E(ApoE)是一種由肝臟合成的富含精氨酸的堿性蛋白，主要參與機體脂代謝過程。有研究證實，ApoE基因多態(tài)性是影響脂代謝紊亂的重要因素之一，而脂代謝紊亂又參與了尿道結石的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。本研究探討了喀什地區(qū)維吾爾族尿道結石患者ApoE基因rs429358和rs7412位點的基因多態(tài)性分布情況及其與尿道結石發(fā)生的關系，旨在為臨床尿道結石的診療及預防提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院泌尿外科2016年6月至2018年6月收治的維吾爾族尿道結石患者216例作為觀察組，其中男127例，女89例；年齡24～70歲，平均(42.52±11.35)歲。納入標準：B超、CT等影像學檢查確診為尿道結石；患者父母均為維吾爾族；臨床資料完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤；合并高血壓等心腦血管疾??；合并泌尿系統(tǒng)感染、尿路畸形等。選取216例同期體檢的維吾爾族健康者作為對照組，其中男119例，女97例；年齡23～71歲，平均(43.62±10.73)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1DNA提取及檢測 所有研究對象清晨空腹采集靜脈血4 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后，根據DNA試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)說明書提取DNA；提取完成后檢測DNA純度，水平>20 ng/μL，且A260/A280為1.7～1.9；采用雙蒸水調整DNA水平至50 ng/μL后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴增及測序 rs429358和rs7412引物序列如表1所示，擴增片段長度分別為240 bp和498 bp。反應體系包括TaqDNA聚合酶2 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，20 mmol/L正向引物和反向引物各0.4 μL，DNA模板0.5～0.6 μL，加無菌去離子水至總反應體積為30 μL。反應條件：95 ℃預熱3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸40～50 s；循環(huán)30次后再延伸10 min。PCR 擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，并于測序儀上完成測序。測序方法：根據高分辨熔解曲線分析的不同曲線和酶切片段大小、數量確定不同的基因型，產物rs429358序列長度為238 bp，rs7412序列長度為384 bp。

表1 rs429358和rs7412引物序列

注：F為正向引物，R為反向引物。

1.2.3ApoE基因多態(tài)性分析 取PCR產物1 μg進行ApoE酶切反應,酶切體系:10×緩沖液2 μL，ApoE內切酶5 μL，DNA 1 μL，加無菌水至總反應體積為20 μL；反應條件為37 ℃ 4 h；酶切終止后采用聚丙烯酰胺凝膠，90 V電壓，電泳2 h，然后用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析基因型。

1.2.4血脂相關指標水平檢測 所有研究對象清晨空腹采集靜脈血3～5 mL，分離血清待測。于貝克曼Au5800全自動生化分析儀上進行總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、載脂蛋白A(ApoA)、載脂蛋白B(ApoB)及ApoE水平檢測。

2 結 果

2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗 對兩組研究對象ApoE基因rs429358和rs7412位點的基因型分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，結果顯示，均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，所納入的研究對象具有人群代表性。見表2。

2.2ApoE基因rs429358和rs7412位點基因型及等位基因頻率比較 觀察組ApoE基因rs429358位點TT、TC基因型頻率分別為70.83%和29.17%，T、C等位基因頻率分別為85.42%和14.58%，與對照組基因型頻率和等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ApoE基因rs429358位點TC基因型攜帶者患尿道結石的風險較TT基因型增加(OR=2.75，95%CI=1.24～6.02)，T等位基因攜帶者患尿道結石的風險較C等位基因增加(OR=2.19,95%CI=1.30～5.64)。觀察組ApoE基因rs7412位點TT、TC、CC基因型頻率分別為1.85%、12.96%和85.19%，T、C等位基因頻率分別為8.33%和91.67%，與對照組基因型頻率和等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

2.3兩組血脂相關指標水平比較 觀察組TG、TC、LDL-C及ApoE水平均高于對照組，HDL-C水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；ApoA和ApoB水平在兩組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表2 ApoE基因rs429358和rs7412位點Hardy-Weinberg平衡檢驗

表3 ApoE基因rs429358和rs7412位點基因型及等位基因頻率比較[n(%)]

表4 兩組血脂相關指標水平比較

3 討 論

尿道結石具體的發(fā)病機制目前尚不明確，有學者認為生活方式、飲食習慣、地域差異及遺傳因素在尿道結石形成過程中發(fā)揮著重要作用[6]。新疆維吾爾自治區(qū)是尿道結石的高發(fā)地區(qū)，該地區(qū)維吾爾族人群由于生活方式和飲食習慣與漢族人群有著較大差異，其尿道結石的發(fā)病率及復發(fā)率明顯高于漢族人群[3]?？κ驳貐^(qū)位于新疆維吾爾自治區(qū)南部，該地區(qū)維吾爾族人群日常飲食以面食和牛羊肉為主，加上常年食用奶制品與茶點，攝入高脂肪和高蛋白食物較多，導致脂代謝紊亂在該地區(qū)發(fā)病率較高；而相關研究證實，脂代謝紊亂與尿道結石的發(fā)生、發(fā)展有關[4-5]。血脂水平升高與ApoE基因表型相關[7-8]，喀什地區(qū)維吾爾族人群ApoE基因多態(tài)性是否與尿道結石的發(fā)生有關，健康人群與尿道結石患者ApoE基因型及等位基因的差異是否對尿道結石的診斷有一定的價值，目前少有報道。因此，本研究對此進行了深入探討，以期為尿道結石的診療及預防提供參考。

葉炳華等[8]、宋雨等[9]報道了國內漢族人群ApoE基因rs429358和rs7412位點包含多種基因型和等位基因，且人群間等位基因和基因型分布存在一定的差異。本研究中，觀察組ApoE基因rs429358位點TT、TC基因型頻率和T、C等位基因頻率與對照組比較有明顯差異，且TC基因型攜帶者患尿道結石的風險較TT基因型增加(OR=2.75,95%CI=1.24～6.02)，T等位基因攜帶者患尿道結石的風險較C等位基因增加(OR=2.19,95%CI=1.30～5.64)。提示TT、TC基因型和T、C等位基因的差異可能是導致喀什地區(qū)維吾爾族人群患尿道結石的可能原因，同時TC基因型、T等位基因可能分別是導致尿道結石的高風險基因型與等位基因。

本研究中，觀察組ApoE基因rs7412位點TT、TC、CC基因型頻率和T、C等位基因頻率與對照組無明顯差異，與吳計超[10]對廣西壯族人群的研究結果類似，提示ApoE基因rs7412位點基因型與基因頻率可能與尿道結石的發(fā)病無關。

王艷梅等[11]、梁愛芬等[12]的研究指出，心血管疾病患者血脂水平與ApoE基因多態(tài)性密切相關，ApoE基因rs429358位點突變患者血脂水平升高，且心腦血管事件的發(fā)生風險也明顯升高。本研究中，觀察組TG、TC、LDL-C及ApoE水平均高于對照組(P<0.05)，HDL-C水平低于對照組(P<0.05)，進一步證實了ApoE基因多態(tài)性與脂代謝紊亂有關，從而增加了尿道結石的發(fā)病風險。

4 結

喀什地區(qū)維吾爾族人群ApoE基因rs429358位點是尿道結石的易感基因位點，其可能通過對血脂水平的影響從而使尿道結石的發(fā)生風險增加，可成為尿道結石早期預防和治療的潛在生物標志物。