基于ABCG2的卵巢癌干樣細(xì)胞分選及體外生物學(xué)研究

龔麗華 朱含笑 周海虹 石智 顏笑健

卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，其中90%為卵巢上皮來(lái)源，由于缺乏早期診斷手段，80%患者確診時(shí)已為晚期。晚期卵巢上皮性癌5年生存率約30%，是嚴(yán)重威脅婦女生命健康的疾病[1]。卵巢癌腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后輔以化療對(duì)Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌患者的完全臨床緩解率只有50%～80%，多數(shù)患者會(huì)復(fù)發(fā)并產(chǎn)生耐藥。研究認(rèn)為，化療“漏殺”或“殺不死”的部分細(xì)胞就是極少數(shù)的具有自我更新、無(wú)限增殖和多向分化潛能的卵巢癌干樣細(xì)胞（ovarian cancer stem cells，OCSCs），正是這群特異性細(xì)胞促使了腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和抗藥性的產(chǎn)生[2-5]。側(cè)群（side population，SP）細(xì)胞是利用Hoechst染料和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行造血干細(xì)胞分離時(shí)發(fā)現(xiàn)的一群特殊細(xì)胞，具有類似干細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能[6]。多藥抗藥性（multidrug resistance，MDR）是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性的同時(shí)，對(duì)結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制不同的其他抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉抗藥性。MDR是腫瘤化療失敗的主要原因，是腫瘤化療領(lǐng)域急需解決的主要難題。三磷酸腺苷結(jié)合盒跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是介導(dǎo)MDR的主要原因之一。功能上，三磷酸腺苷結(jié)合盒跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為能量依賴性的抗腫瘤藥物外排泵，可使腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物積累減少，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抗藥。三磷酸腺苷結(jié)合盒跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2（ATP-binding cassettesubfamilyGmember2，ABCG2）可以外排Hoechst33342。采用Hoeschst33342染色分選SP細(xì)胞是目前較常用的方法，正是利用干樣細(xì)胞對(duì)Hoechst33342染料外排的特性[7]，ABCG2被認(rèn)為是腫瘤干樣細(xì)胞的生物標(biāo)志物之一[8]。本研究采用Hoechst33342染色流式分選卵巢癌細(xì)胞株中的SP細(xì)胞，采用ABCG2特異性抑制劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的維拉帕米作為對(duì)照組分選非側(cè)群（non side population，NSP）細(xì)胞；通過(guò)噻唑藍(lán)（MTT）法、體外克隆形成實(shí)驗(yàn)比較SP細(xì)胞與NSP細(xì)胞的增殖能力，體外分化后再次檢測(cè)細(xì)胞中的SP細(xì)胞比例驗(yàn)證其體外分化能力，通過(guò)比較SP細(xì)胞與NSP細(xì)胞對(duì)不同化療藥物敏感性探討其抗藥性差異，最后通過(guò)檢測(cè)ABCG2+細(xì)胞比例驗(yàn)證SP細(xì)胞和ABCG2的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 HO-8910PM、OVCAR-3、SKOV-3人卵巢癌細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 藥品和試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、ABCG2抗體購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，ABCG2特異性抑制劑 FTC、MTT、碘化丙啶（PI）、胰酶和 Hoechst33342 均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。順鉑、紫杉醇、吉西他濱、多柔比星購(gòu)自齊魯制藥有限公司。

1.1.3 儀器 流式細(xì)胞分選儀、流式細(xì)胞分析儀均為美國(guó)Becton Dickinson公司產(chǎn)品，Spectra Max M2多功能酶標(biāo)儀為美國(guó)Molecular Devices公司產(chǎn)品，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)均為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù)分選卵巢癌SP細(xì)胞 培養(yǎng)HO-8910PM、OVCAR-3、SKOV-3卵巢癌細(xì)胞株至覆蓋10cm平皿底面積約70%時(shí)，以0.25%胰酶/0.02%EDTA消化液消化細(xì)胞，1 000r/min離心收集細(xì)胞。用37℃預(yù)熱的含2%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，用移液槍槍頭輕柔混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/ml，將細(xì)胞懸液分裝入2只50ml離心管內(nèi)，分別為實(shí)驗(yàn)組與FTC抑制組。FTC抑制組管內(nèi)加入1μmol/L的FTC。兩組均加入終濃度5μg/ml的Hoechst33342。將兩組細(xì)胞置于37℃水浴搖床中避光水浴90min，注意離心管的液面置于水浴液面之下，保證恒溫。冰上終止反應(yīng)，將細(xì)胞懸液置于流式管中，4℃下1 200r/min離心5min，棄上清液，4℃預(yù)冷的PBS溶液洗滌2次，重懸于500μl 4℃預(yù)冷的PBS溶液中。水浴結(jié)束后至上機(jī)前均需4℃避光保存細(xì)胞。上機(jī)前，加入終濃度為2μg/ml的PI，400目濾網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)（檢測(cè)量＞10 000個(gè)細(xì)胞/管）。Hoechst33342激發(fā)波長(zhǎng)為355nm，用610nm雙色短通反射濾鏡（DSP）作分色，450/40nm和675nm邊緣長(zhǎng)通濾片分別檢測(cè)散射光藍(lán)光及紅光部分；PI的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，于575/26nm收集紅光。去除PI直接染色陽(yáng)性的死細(xì)胞，以 Hoechst Red為X軸，Hoechst Blue為Y軸作二維散點(diǎn)圖。設(shè)門選中低HoechstRed及低HoechstBlue且FTC組缺失的區(qū)域?yàn)镾P細(xì)胞，檢測(cè)SP細(xì)胞在各卵巢癌細(xì)胞系中的比例。對(duì)于存在SP表型的細(xì)胞系分別進(jìn)行SP和NSP細(xì)胞的分選。

1.2.2 MTT法檢測(cè)SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞克隆形成及增殖能力 將分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞懸液離心、洗滌后重懸于完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度1×104/ml，接種至6孔板，37℃，培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)，每5d更換培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)7、10、14d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入50μl MTT（0.5mg/ml）繼續(xù)培養(yǎng) 4h，待結(jié)晶形成后吸盡上清液，觀察細(xì)胞克隆結(jié)晶形成情況，然后每孔加入100μl DMSO溶解結(jié)晶后測(cè)定570nm的吸光值（OD值），比較SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞克隆形成及增殖能力。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SP細(xì)胞體外分化能力 將SP細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周，換液1次/3d。將細(xì)胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化，按照1.2.1中方法步驟進(jìn)行Hoechest33342染色，再次進(jìn)行SP細(xì)胞比例的檢測(cè)。對(duì)比接種前后SP細(xì)胞比例的變化，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 MTT法檢測(cè)SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性 將兩種細(xì)胞離心、洗滌后重懸于完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/ml，接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后加入4種濃度的順鉑（0.03、0.1、0.3、1mmol/L）、紫杉醇（0.3、1、3、10μmol/L）、吉西他濱（0.3、1、3、10μmol/L）、多柔比星（0.3、1、3、10μmol/L），每種濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)孔，并分別留4孔細(xì)胞不加藥物作為空白對(duì)照，72h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活性，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為490nm下測(cè)定OD值。藥物抑制率=（1-OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組/OD對(duì)照組-OD空白組）×100%。半數(shù)抑制濃度（IC50）的計(jì)算應(yīng)用 Bliss法，并比較不同藥物對(duì)SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的IC50，繪制細(xì)胞生存曲線觀察細(xì)胞生存率。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞ABCG2+細(xì)胞比例 培養(yǎng) HO-8910PM、OVCAR-3、SKOV-3卵巢癌細(xì)胞株至覆蓋10cm平皿底面積約70%時(shí)，0.25%胰酶/0.02%EDTA消化液消化細(xì)胞，1 000r/min離心收集細(xì)胞。1%FBS封閉1h，將細(xì)胞分成兩組：實(shí)驗(yàn)組加入鼠抗人 CD338（ABCG2）一抗，對(duì)照組用同型鼠IgG孵育3h，離心、洗滌細(xì)胞。兩組細(xì)胞均用羊抗鼠-PE二抗孵育1h，離心、洗滌細(xì)胞后用300μl PBS重懸細(xì)胞上流式分析儀檢測(cè)CD338+（ABCG2+）細(xì)胞比例。采用Flow jo7.6軟件計(jì)算ABCG2+細(xì)胞比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌細(xì)胞中SP細(xì)胞分選結(jié)果 3株卵巢癌細(xì)胞均檢測(cè)到不同比例的SP細(xì)胞，ABCG2拮抗劑FTC拮抗后，SP細(xì)胞的比例明顯下降，說(shuō)明所測(cè)的SP細(xì)胞外排Hoechest33342主要依靠ABCG2泵。卵巢癌細(xì)胞中SP細(xì)胞比例的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。為驗(yàn)證分選的純度，對(duì)卵巢癌OVCAR3細(xì)胞分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞測(cè)定其中的細(xì)胞組成，SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的分選純度分別為95.3%和94.5%，說(shuō)明本研究的分選到達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，純度分析結(jié)果見(jiàn)圖2，后續(xù)采用卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞株分選的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞體外分化能力比較 卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后，再次檢測(cè)兩群細(xì)胞的SP比例。發(fā)現(xiàn)SP來(lái)源的細(xì)胞SP的比例為6.8%，與分選前SP比例相似，說(shuō)明SP細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外長(zhǎng)期分化，形成了以少量SP細(xì)胞和多數(shù)NSP細(xì)胞形成的異質(zhì)性細(xì)胞群體。NSP細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞中檢測(cè)到2.3%的低染細(xì)胞，比未分選前比例低，這部分低染細(xì)胞可能來(lái)自于分選的NSP細(xì)胞中存在少量SP細(xì)胞。NSP細(xì)胞體外分化能力明顯弱于SP細(xì)胞，見(jiàn)圖3。

2.3 卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞增殖及克隆形成能力比較 SP細(xì)胞體外克隆形成能力明顯高于NSP細(xì)胞，見(jiàn)圖4（插頁(yè)）。SP細(xì)胞增殖能力也明顯高于NSP細(xì)胞（不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較，P＜0.05），見(jiàn)圖5。

2.4 卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性比較 SP細(xì)胞對(duì)順鉑、紫杉醇、吉西他濱及多柔比星的化療敏感性均差于NSP細(xì)胞（均P＜0.05），說(shuō)明SP對(duì)卵巢癌常規(guī)的化療藥物具有更強(qiáng)的抗藥性，測(cè)定SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞分別對(duì)這4種藥物的IC50比較見(jiàn)表1，繪制細(xì)胞生存曲線見(jiàn)圖6。

圖1 卵巢癌細(xì)胞中SP細(xì)胞比例檢測(cè)流式細(xì)胞圖

圖2 OVCAR-3卵巢癌SP細(xì)胞分選純度分析流式細(xì)胞圖

圖3 卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞體外分化能力比較流式細(xì)胞圖

圖4 卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞克隆形成能力比較（注：不同時(shí)間點(diǎn)運(yùn)用MTT染料使活細(xì)胞產(chǎn)生紫藍(lán)色結(jié)晶）

圖5 OVCAR-3細(xì)胞分選的SP細(xì)胞和NSP增殖能力比較

2.5 卵巢癌細(xì)胞SP細(xì)胞比例與ABCG2+細(xì)胞比例比較 應(yīng)用流式分析儀檢測(cè)了不同卵巢癌細(xì)胞株中ABCG2+細(xì)胞比例見(jiàn)圖7，與SP細(xì)胞比例均呈正相關(guān)（均P＜0.05），見(jiàn)表 2。

表1 卵巢癌OVCAR3細(xì)胞分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞對(duì)不同化療藥的IC50比較（μmol/L）

表2 卵巢癌細(xì)胞ABCG2+細(xì)胞比例與SP細(xì)胞比例的相關(guān)性

圖6 卵巢癌OVCAR3細(xì)胞分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞不同化療藥物干預(yù)的細(xì)胞生存曲線

圖7 卵巢癌細(xì)胞ABCG2+細(xì)胞比例圖

3 討論

OCSCs被證實(shí)具有與干細(xì)胞相似的自我更新和多向分化潛能，被認(rèn)為是卵巢癌細(xì)胞抗藥與復(fù)發(fā)的根源[9]。研究表明通過(guò)靶向下調(diào)ABCG2可以逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)鉑類的抗藥[10]。研究者們希望通過(guò)腫瘤干樣細(xì)胞研究找到其高復(fù)發(fā)率、高耐藥率的原因，給予其有效的靶向治療。

本研究圍繞腫瘤干樣細(xì)胞自我更新和分化的潛能特點(diǎn)，論證了SP表型作為OCSCs的可行性，初步探索了ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)體與卵巢癌細(xì)胞SP表型的關(guān)系。本研究采用ABCG2抑制劑FTC作為側(cè)群法流式細(xì)胞分選對(duì)照組的抑制劑，與以往的利血平、維拉帕米等P-gp受體抑制劑比較，發(fā)現(xiàn)ABCG2抑制劑具有良好的抑制效果，間接說(shuō)明代表OCSCs的SP細(xì)胞與ABCG2受體存在密切相關(guān)性，卵巢癌細(xì)胞外排Hoechst33342主要通過(guò)ABCG2泵作用。腫瘤干樣細(xì)胞對(duì)常規(guī)的化療藥物抗藥可能與ABCG2、MDR1表達(dá)增高和TLR4/MyD88有關(guān)。應(yīng)該指出，Hoechst 33342不僅是ABCG2的底物，同時(shí)也是ABCB1/P-gp的底物，但有報(bào)道在胚胎細(xì)胞中，剔除mdr1基因?qū)oechst 33342外排無(wú)影響，但剔除ABCG2基因后，Hoechst 33342細(xì)胞內(nèi)積累明顯增加[11]。有研究表明以藥物誘導(dǎo)使細(xì)胞ABCG2表達(dá)增高時(shí)，腫瘤干樣細(xì)胞比例增高[12]。

本研究中3株卵巢癌細(xì)胞均存在SP表型。對(duì)卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行Hoechst33342分選的卵巢癌SP表型與NSP細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期體外培養(yǎng)，SP細(xì)胞在體外通過(guò)自我更新和分化重新形成了與分選前細(xì)胞相似的由SP和NSP細(xì)胞組成的在表型上和功能上異質(zhì)性的細(xì)胞群體。雖然NSP細(xì)胞經(jīng)長(zhǎng)期體外分化后也存在Hoechst33342低染細(xì)胞群，但其比例較分選前細(xì)胞低，可能是由分選的NSP細(xì)胞內(nèi)含有少量的SP細(xì)胞經(jīng)分化而形成，畢竟分選的純度不是100%。體外分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SP表型細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新分化的能力?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)中也可以部分反映細(xì)胞的自我更新和增殖能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，卵巢癌細(xì)胞中SP細(xì)胞比NSP細(xì)胞的克隆形成能力更強(qiáng)，細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)?；熕幬锩舾袑?shí)驗(yàn)中，通過(guò)生存曲線發(fā)現(xiàn)卵巢癌SP細(xì)胞相比NSP細(xì)胞對(duì)多種化療藥物具有更高的抗藥性，在各個(gè)濃度的生存率較高。

既往研究顯示卵巢癌細(xì)胞中存在致瘤性較強(qiáng)的SP細(xì)胞[7，13]。卵巢癌A2780細(xì)胞株中Hoechst 33342分選的OCSCs ABCG2分子表達(dá)量明顯高于NSP細(xì)胞，免疫磁珠法篩出ABCG2+細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受能力則明顯高于ABCG2-細(xì)胞，ABCG2+細(xì)胞加入ABCG2單克隆抗體孵育后能使ABCG2+細(xì)胞對(duì)化療藥物的抗藥性明顯降低，說(shuō)明ABCG2分子是參與維持卵巢癌細(xì)胞多藥耐藥性的一個(gè)主要分子標(biāo)志[14-15]，以往的研究也證實(shí)ABCG2與多種腫瘤化療耐藥相關(guān)。本研究通過(guò)分析卵巢癌細(xì)胞中ABCG2+細(xì)胞比例與SP細(xì)胞比例的關(guān)系，間接反映了OCSCs與ABCG2的關(guān)系。結(jié)果表明卵巢癌細(xì)胞中ABCG2+細(xì)胞比例與其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞株中SP細(xì)胞比例呈正相關(guān)。但是需要進(jìn)一步對(duì)分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)提取后通過(guò)RT-PCR和蛋白免疫印跡法測(cè)定兩者ABCG2在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)差異，才能獲取更為直接的證據(jù)。

綜上所述，本研究對(duì)卵巢癌以SP表型為代表的OCSCs所進(jìn)行的生物學(xué)特點(diǎn)的研究說(shuō)明，OCSCs具有較強(qiáng)的自我更新和多向分化的潛能，對(duì)多種化療藥物具有較強(qiáng)的抗藥性，是卵巢癌細(xì)胞抗藥和復(fù)發(fā)的原因之一。OCSCs比例與耐藥蛋白ABCG2呈正相關(guān)，兩者可為卵巢癌治療中逆轉(zhuǎn)抗藥提供新的靶點(diǎn)。