血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

董惠 王衛(wèi)峰 馮玉良 朱琴 叢衍群 張虹 鄭培奮

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，其病死率較高[1]。近年來(lái)由于飲食結(jié)構(gòu)及生活環(huán)境的變化，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率也逐年升高[2]。結(jié)直腸癌的發(fā)生涉及復(fù)雜的生物遺傳方面的多級(jí)聯(lián)反應(yīng)[3]，而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）變化可能是結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的機(jī)制之一。筆者基于當(dāng)前Oncomine、人類蛋白質(zhì)圖譜（human protein atls，HPA）、GEPIA可視化的癌癥大數(shù)據(jù)公共在線平臺(tái)，分析ACE2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)以及與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 資料來(lái)源 本研究資料來(lái)源于Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.oncomine.org/resource）、HPA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.proteinatlas.org/）、GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn）。

1.2 數(shù)據(jù)提取 （1）Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)：可提供腫瘤和正常組織的基因差異表達(dá)分析。本研究設(shè)定的數(shù)據(jù)挖掘及篩選條件：①gene：ACE2：colorectal cancer；②cancer type；③data type：mRNA；④analysis type：cancer vs normal analysis；⑤設(shè)定臨界值（P＜0.01，fold change＞2，gene rank=top10%）。（2）HPA數(shù)據(jù)庫(kù)：研究人員使用高度特異性的抗體，用免疫檢測(cè)技術(shù)測(cè)定蛋白在細(xì)胞系、人類正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)情況，該數(shù)據(jù)庫(kù)繪制了人體正常組織、細(xì)胞以及腫瘤組織、細(xì)胞中表達(dá)基因編碼的蛋白位置。本研究以ACE2、結(jié)直腸癌為關(guān)鍵篩選條件：①search：ACE2；②type：tissue atlas：colorectal caner。在搜索框中輸入ACE2，分別選擇“tissue”及“pathology”，組織來(lái)源選擇“colon”。（3）GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)：可整合分析癌癥表達(dá)譜數(shù)據(jù)。在搜索框中輸入ACE2，分析工具欄里選擇“correlation analysis”，datasets selection為“COAD、READ”，置信區(qū)間設(shè)置為95%。其他參數(shù)均設(shè)置為數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)。分析ACE2基因與結(jié)直腸癌發(fā)生關(guān)系密切的錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)的相關(guān)性后，再應(yīng)用“survival plots”模塊進(jìn)一步分析ACE2基因與結(jié)直腸癌生存預(yù)后的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用數(shù)據(jù)庫(kù)自帶模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)直腸癌組織與正常結(jié)直腸組織中ACE2基因表達(dá)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；ACE2基因表達(dá)量與錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，結(jié)直腸癌患者ACE2基因高、低表達(dá)組生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACE2在常見腫瘤組織中的基因表達(dá)情況 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)共收集330項(xiàng)關(guān)于ACE2在不同類型腫瘤組織與正常組織中基因表達(dá)比較的研究結(jié)果，其中29項(xiàng)研究結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），包括ACE2基因表達(dá)增高的研究5項(xiàng)，降低的研究24項(xiàng)。其中ACE2在結(jié)直腸癌中基因表達(dá)增高的研究0項(xiàng)，降低的研究2項(xiàng)，見圖1（插頁(yè)）。

2.2 ACE2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)有7個(gè)數(shù)據(jù)集包括583個(gè)樣本涉及結(jié)直腸癌組織與正常結(jié)直腸組織ACE2基因表達(dá)的比較，選擇低表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果其中3個(gè)數(shù)據(jù)集中的3項(xiàng)分析顯示結(jié)直腸癌組織中ACE2基因表達(dá)量低于正常結(jié)直腸組織（均P＜0.01），見圖2（插頁(yè)）和圖3。若選擇高表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)3項(xiàng)數(shù)據(jù)集中ACE2基因表達(dá)量在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，但3者進(jìn)行差異基因分析，結(jié)果顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)腸癌及直腸癌的研究包括1 034個(gè)樣本，分別對(duì)結(jié)直腸癌組織及正常組織ACE2轉(zhuǎn)錄水平情況進(jìn)行比較，結(jié)果顯示ACE2在結(jié)直腸癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于正常結(jié)直腸組織（均 P＜0.05），見圖4。

2.3 ACE2在正常結(jié)腸組織與結(jié)腸癌組織中的蛋白表達(dá)比較 從HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中得到ACE2基因表達(dá)篩選結(jié)果，顯示ACE2在結(jié)直腸癌組織中的蛋白表達(dá)明顯高于正常結(jié)直腸組織，見圖5（插頁(yè)）。

2.4 ACE2基因表達(dá)量與錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)量的相關(guān)性 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)性分析模塊，對(duì)ACE2基因表達(dá)量與MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、PMS2等6種錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示均有明顯相關(guān)性（均 P＜0.05），見圖 6（插頁(yè)）。

2.5 結(jié)直腸癌患者ACE2基因高、低表達(dá)組生存率比較 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)生存分析模塊進(jìn)行分析，結(jié)果顯示結(jié)腸癌或直腸癌患者ACE2基因高、低表達(dá)組總生存率、無(wú)病生存率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖 7（插頁(yè)）。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)ACE2在常見腫瘤組織中的基因表達(dá)情況

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)ACE2在結(jié)直腸癌組織中的基因表達(dá)（1～3表示3項(xiàng)研究結(jié)果，藍(lán)色越深表示ACE2基因在該芯片中的表達(dá)越低）

圖3 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)3項(xiàng)研究關(guān)于結(jié)直腸癌組織與正常結(jié)直腸組織ACE2基因表達(dá)的比較

圖4 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)ACE2在結(jié)直腸癌組織與正常結(jié)直腸組織中的基因表達(dá)（*P＜0.05）

圖5 HPA數(shù)據(jù)庫(kù)ACE2在正常結(jié)腸組織與結(jié)腸癌組織中的蛋白表達(dá)（免疫組化染色，電子顯微鏡下觀察，×40）

圖6 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)ACE2基因表達(dá)量與錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)量相關(guān)性的散點(diǎn)圖（a、b、c、d、e、f分別表示ACE2基因表達(dá)量與MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、PMS2 基因表達(dá)量的相關(guān)性）

圖7 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)ACE2基因高、低表達(dá)的結(jié)直腸癌患者生存曲線（a、c：結(jié)腸癌；b、d：直腸癌）

3 討論

ACE2發(fā)現(xiàn)于2000年，是ACE同系物[4]，大量存在于腸上皮細(xì)胞、肺泡Ⅱ型細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ACE2過(guò)表達(dá)可以減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等，進(jìn)而減少胰島細(xì)胞[6]、肺內(nèi)皮細(xì)胞[7]、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[8]的凋亡，抑制心肌梗死后心肌纖維化[9]。但是，目前關(guān)于ACE2在腸道中的作用尚未完全明確。Bernardi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸腫瘤患者ACE2蛋白活性明顯升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量有限及樣本間存在高度變異性相關(guān)。房靜遠(yuǎn)教授團(tuán)隊(duì)近期對(duì)正常人和結(jié)直腸腫瘤患者結(jié)腸上皮細(xì)胞ACE2進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞、腺瘤、結(jié)直腸癌組織中ACE2表達(dá)量逐漸增加[11]。

本研究通過(guò)Onconimine數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘ACE2基因在常見腫瘤中的表達(dá)情況，結(jié)果在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的29項(xiàng)研究中，24項(xiàng)研究的ACE2基因表達(dá)量降低；其中關(guān)于結(jié)直腸癌的研究中有2項(xiàng)研究提示低表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌ACE2在不同研究的數(shù)據(jù)集中，結(jié)果顯示高、低表達(dá)均有報(bào)道，這可能與樣本量大小有關(guān)。通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，ACE2在結(jié)腸癌及直腸癌的轉(zhuǎn)錄水平較正常組織高。利用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)提供的免疫組化信息，在蛋白水平上比較結(jié)直腸癌組織與正常組織中ACE2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中ACE2蛋白呈高表達(dá)，提示ACE2在結(jié)直腸癌的發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮重要的作用。另外，結(jié)直腸癌患者中ACE2在基因及蛋白水平的表達(dá)也存在差異：一方面，ACE2在腫瘤的不同分期及病理類型中基因表達(dá)量可能不同；另一方面，蛋白的表達(dá)不僅受基因豐度水平的影響，還涉及轉(zhuǎn)錄后基因產(chǎn)物的修飾等機(jī)制[12]。但在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中，不同數(shù)據(jù)集中ACE2基因在結(jié)直腸癌的表達(dá)存在分歧，提示目前仍需要開展大樣本的臨床研究，以進(jìn)一步明確ACE2在基因水平的表達(dá)情況。

結(jié)腸細(xì)胞在DNA復(fù)制過(guò)程中若出現(xiàn)堿基錯(cuò)配，可引起子代DNA鏈突變，進(jìn)而造成新生細(xì)胞性狀的改變，甚至引起癌變[13]。機(jī)體內(nèi)的基因錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)包括MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6、PMS1和PMS2。錯(cuò)配修復(fù)基因的突變或功能缺失，是結(jié)腸癌發(fā)生的重要機(jī)制之一[14]。通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)提供的相關(guān)性分析模塊，發(fā)現(xiàn)ACE2與基因錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)中的MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1 和 PMS2 基因的表達(dá)具有明顯相關(guān)性，表明ACE2基因可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)病過(guò)程。但是ACE2的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的生存預(yù)后無(wú)相關(guān)性。鑒于目前的研究結(jié)果，仍需要探究結(jié)直腸癌在不同分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況下ACE2基因及蛋白的表達(dá)變化，以進(jìn)一步明確ACE2在結(jié)直腸癌發(fā)病過(guò)程中的作用。

綜上所述，本研究通過(guò)多種大樣本的公共在線數(shù)據(jù)庫(kù)和系統(tǒng)的生物信息學(xué)方法明確了ACE2蛋白在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，同時(shí)表明生物信息學(xué)分析可提供更多潛在的結(jié)直腸癌的重要基因，為結(jié)直腸癌的治療研究提供新的方向。