解淀粉芽孢桿菌NS2降解玉米赤霉烯酮的研究

張晨曦 Yawa Minnie Elodie Folly 趙月菊 劉 陽

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運(yùn)管控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是一種非甾體雌激素真菌毒素,可通過聚酮類合成代謝途徑在各種鐮刀菌屬(Fusarium)真菌中進(jìn)行生物合成,如禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、半裸鐮刀菌(Fusariumsemitectum)、克魯克韋倫斯鐮刀菌(Fusariumcrookwellense)、黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)和木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)等[1]。ZEN 毒素是污染最為廣泛的毒素之一,具有遺傳毒性、細(xì)胞毒性、血液毒性、肝毒性、腎毒性和免疫毒性,其中遺傳毒性最為嚴(yán)重[2]。ZEN 的化學(xué)式與雌二醇類似,可以競(jìng)爭(zhēng)性地與雌激素受體結(jié)合,從而在人和動(dòng)物中蓄積引發(fā)雌激素效應(yīng),如影響雌性哺乳動(dòng)物胸部乳腺發(fā)育、引發(fā)排卵不規(guī)律、外陰炎癥甚至造成假性懷孕、流產(chǎn)等[3-6]。近年來,在全球20 多個(gè)國家的食品和飼料調(diào)查中,ZEN毒素污染十分廣泛[7]。如2017年,周建川等[8]測(cè)定了1 034 個(gè)飼料原料及配合飼料樣品中的ZEN 含量,玉米副產(chǎn)物、全價(jià)飼料的超標(biāo)率分別達(dá)28.89%和13.53%。朱文倩[9]采集了我國159 例玉米油樣本,對(duì)其ZEN 含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示大多數(shù)玉米油中都含有ZEN 毒素,濃度最高可達(dá)1 950 μg·kg-1,遠(yuǎn)超過歐盟植物油中ZEN 的限量(400 μg·kg-1)[10]。由此可見,我國食品和飼料中ZEN 的污染十分嚴(yán)重,應(yīng)引起人們足夠的重視。篩選高效降解ZEN 的脫毒菌,開發(fā)有效安全的脫毒技術(shù),可為研發(fā)食品和飼料ZEN 污染預(yù)警技術(shù)、防控和脫毒技術(shù)提供理論依據(jù)和方法途徑,具有十分重要的科學(xué)意義。

生物消減技術(shù)可在溫和條件下去除真菌毒素,具有高效、特異、環(huán)境友好的特點(diǎn),同時(shí)也極少會(huì)造成食品和飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的損失以及口味風(fēng)味的改變[11-12]。研究表明多數(shù)真菌和細(xì)菌具有去除ZEN 的功能,Zhang 等[13]篩選到1 株對(duì)ZEN 具有高效去除作用的釀酒酵母,可在48 h 內(nèi)完全消減5 μg·mL-1的ZEN；葛嬋嬋等[14]篩選到2 株芽孢桿菌,可在8 h 內(nèi)將10 μg·mL-1的ZEN 完全消減,主要活性成分來源于胞外酶；龍淼等[15]報(bào)道紅球菌(Rhodococcussp.)SYA13,可在72 h 將5 μg·mL-1的ZEN 去除87.1%。但是僅根據(jù)檢測(cè)ZEN 的含量來衡量脫毒效果存在不科學(xué)性,因?yàn)槿コ舅夭⒉坏扔诮到獬蔁o毒產(chǎn)物。如ZEN 可通過C-6’-酮羰基還原途徑,代謝為2 種立體異構(gòu)體,即α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol,α-ZOL)和β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol,β-ZOL)。這2 種物質(zhì)均具有雌激素效應(yīng),且三者的雌性激素活性順序依次為α-ZOL＞ZEN ＞β-ZOL,其中α-ZOL 的毒性為ZEN 的200%[16]。通過這種代謝途徑反而增強(qiáng)了毒性效應(yīng),并不是真正的脫毒。因此研究生物降解機(jī)制,分析降解產(chǎn)物的毒性以及對(duì)在食品和動(dòng)物飼料中添加微生物的安全性評(píng)價(jià)具有重要的意義。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一種益生菌,是歐洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)認(rèn)定的安全菌株,可作為飼料添加劑[17]。該菌已多年用于生產(chǎn)商業(yè)中重要的酶和代謝物[18],如淀粉酶和β-葡聚糖酶已被列為農(nóng)業(yè)部令(2013年2045 號(hào))允許使用的酶制劑類飼料添加劑。解淀粉芽孢桿菌還具有抑制灰葡萄孢、鏈格孢、尖孢鐮刀菌、大腸桿菌、沙門氏菌等多種病原菌生長(zhǎng)的作用[19]。張子豪等[20]從土壤中篩選到1 株解淀粉芽孢桿菌,其對(duì)大腸埃希氏菌具有顯著的抑菌效果,抑菌圈直徑可達(dá)25.5±0.5 mm。劉宇帥等[21]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌通過分泌抗菌脂肽芬芥素對(duì)尖孢鐮刀菌和禾谷鐮刀菌顯示出較強(qiáng)的抑菌活性。陳楠楠等[22]在探究解淀粉芽孢桿菌抗菌機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌能夠產(chǎn)生種類繁多的抑菌物質(zhì),有效地抑制真菌和其他細(xì)菌的活性。這些研究充分說明解淀粉芽孢桿菌具有充分的應(yīng)用潛力和商業(yè)價(jià)值。

本研究篩選到1 株對(duì)ZEN 具有明顯降解效果的菌株NS2,經(jīng)16S rDNA 鑒定發(fā)現(xiàn)其為解淀粉芽孢桿菌,分別在液體培養(yǎng)基和固態(tài)發(fā)酵中研究了菌株NS2對(duì)ZEN 的降解能力,并對(duì)其降解產(chǎn)物以及代謝途徑進(jìn)行了分析,同時(shí)對(duì)該菌株抗微生物活性進(jìn)行評(píng)估,旨在為ZEN 解毒產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 樣品與主要試劑 玉米、小麥、大麥3 種糧食樣品,從我國湖南、江蘇、四川、安徽、江西、河北、山西,7 個(gè)省份采集,于-20℃保存,具體采集信息見表1。ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)、α-ZOL 和β-ZOL,購自德國Sigma-Aldrich 公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)等相關(guān)分子試劑,購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純,其他化學(xué)試劑為分析純。

表1 樣品采集信息Table 1 Sample collection information

1.1.2 主要培養(yǎng)基 無機(jī)鹽培養(yǎng)基(minimal medium,MM)[23]：1.6 g·L-1Na2HPO4、1 g·L-1KH2PO4、0.5 g·L-1MgSO4·7H2O、0.5 g·L-1NaNO3、0.5 g·L-1(NH4)2SO4、0.025 g·L-1CaCl2·2H2O,于121℃高壓滅菌15 min 后加入2 mL 微量金屬溶液和1 mL 維生素溶液。

微量金屬溶液(trace metal solution)：1.5 g·L-1FeCl2·4H2O、0.19 g·L-1CoCl2·6H2O、0.1 g·L-1MnCl2·4H2O、0.07 g·L-1ZnCl2、0.062 g·L-1H3BO3、0.036 g·L-1Na2MoO4·2H2O、0.024 g·L-1NiCl2·6H2O、0.017 g·L-1CuCl2·2H2O,用無菌過濾器(0.22 μm)過濾。

維生素溶液：2 mg·L-1生物素、2 mg·L-1葉酸、5 mg·L-1核黃素、5 mg·L-1煙酸、5 mg·L-1硫銨素鹽酸鹽、10 mg·L-1吡哆醇鹽酸鹽、50 mg·L-1維生素B12、5 mg·L-1泛酸鈣、5 mg·L-1對(duì)氨基苯甲酸、5 mg·L-1硫辛酸,用無菌過濾器(0.22 μm)過濾。

營(yíng)養(yǎng)肉湯(nutrient broth,NB)培養(yǎng)基[24]：10 g·L-1蛋白胨、3 g·L-1牛肉膏、5 g·L-1NaCl,121℃高壓滅菌15 min。

營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂(nutrient broth agar,NA)培養(yǎng)基：10 g·L-1蛋白胨、3 g·L-1牛肉膏、5 g·L-1NaCl、15 g·L-1瓊脂,121℃高壓滅菌15 min。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HR30-IIA2 型生物安全柜,青島海爾股份有限公司；LS-50HD 型立式壓力蒸汽滅菌鍋,江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；DRP-9052 型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SZ2-1LST 型電子顯微鏡,日本Olympus 公司；SCIENTZ-950E 超聲波細(xì)胞破碎機(jī),寧波新芝生物科技有限公司；T100 型PCR 儀,美國Bio-Rad 公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀、Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent 6520 ESI-Q-TOF,美國安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 降解ZEN 菌株分離 采用王國兵等[25]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱量10 g 糧食樣品置于250 mL 無菌三角瓶中,加入90 mL 無菌蒸餾水,28℃、180 r·min-1震蕩15 min 后獲得細(xì)菌懸浮液。用無菌蒸餾水稀釋至濃度梯度10-6、10-7、10-8,取100 μL 涂布在NA 平板上。30℃培養(yǎng)24 h 后用接種環(huán)挑取不同形態(tài)的單菌落,劃線于NA 平板上純化。將純化后的菌株接種到NB 培養(yǎng)基中,30℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h,獲得純化后菌液。

1.3.2 降解ZEN 菌株篩選 試驗(yàn)組：向無菌10 mL離心管中加入985 μL 新鮮MM 和5 μL 100 μg·mL-1的ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品。加入10 μL 1.3.1 所述的純化后菌液,充分混勻,于28℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)72 h。對(duì)照組：取10 μL 不接菌的NB 培養(yǎng)基加入990 μL 含5 μg·mL-1ZEN 的MM 中[26]。

使用Romer 免疫親和凈化柱對(duì)ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照組、試驗(yàn)組樣品中毒素進(jìn)行凈化提取,用高效液相色譜熒光檢測(cè)器(high performance liquid chromatographyfluorescence detector,HPLC-FLD)對(duì)凈化提取得到的樣品進(jìn)行檢測(cè)[27]。

Romer 免疫親和凈化柱提取方法[27]：取1 mL 樣品,加入5 mL 84%乙腈,混勻,旋渦震蕩3 min。10 000 r·min-1離心5 min 后用0.22 μm 過濾器過濾。取3 mL 過濾后樣品,加入25 mL 20 mmol·mL-1pH 值7.4 的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)過免疫親和柱。用10 mL PBS 淋洗,0.5 mL 甲醇洗脫3 次,過0.22 μm 過濾器。

HPLC-FLD 檢測(cè)條件[28]：流動(dòng)相乙腈∶水＝70∶30；流速1 mL·min-1；色譜柱：Agilent ZorbaxSB-C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；激發(fā)波長(zhǎng)274 nm,發(fā)射波長(zhǎng)440 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL。

ZEN 降解率＝(對(duì)照組殘留ZEN 含量-試驗(yàn)組殘留ZEN 含量)/對(duì)照組ZEN 含量×100%[29]。

1.3.3 ZEN 降解菌鑒定 ZEN 降解菌形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定方法參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[30]。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中的試驗(yàn)方法[31]利用細(xì)菌16S rDNA 通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′；1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)菌株NS2 的16S rDNA 基因序列進(jìn)行測(cè)定分析,測(cè)序結(jié)果在NCBI 使用BLAST 比對(duì),從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲得與菌株16S rDNA 源的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)[32],并利用軟件MEGA 7.0 采用最大似然法分析NS2 的16S rDNA基因與相似種屬的進(jìn)化關(guān)系[33]。

1.3.4 ZEN 降解菌特性分析

1.3.4.1 降解菌的抗微生物活性試驗(yàn) 參照Teather等[34]和Guo 等[35]的方法。將ZEN 降解菌點(diǎn)在NA 平板中心,于28℃培養(yǎng)24 h 后,轉(zhuǎn)移至氯仿蒸汽中,30 min,將氯仿蒸發(fā)20 min。取NB 中的0.1 mL 108CFU·mL-1大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌涂布在平板上,并將樣品于28℃培養(yǎng)16～18 h,測(cè)量抑制圈直徑。

1.3.4.2 降解菌的木聚糖酶、羧甲基纖維素酶、蛋白酶活性測(cè)定 在分別含有木聚糖、羧甲基纖維素和脫脂乳的固體培養(yǎng)基上檢測(cè)ZEN 降解菌細(xì)胞外木聚糖酶、羧甲基纖維素酶和蛋白酶活性。具體操作：將ZEN 降解菌點(diǎn)在含0.5%木聚糖-NA 平板中心,并于28℃培養(yǎng)72 h 后,加入0.5%剛果紅染色15 min,然后用1 mol·L-1NaCl 溶液洗滌2 次除去過量的染料,菌落周圍若出現(xiàn)清晰區(qū)域則表明有木聚糖酶產(chǎn)生；與木聚糖酶活性測(cè)定類似,含0.5% 羧甲基纖維素-NA 平板用于羧甲基纖維素酶測(cè)定；在脫脂乳平板上檢測(cè)蛋白酶活性[36]。

1.3.5 ZEN 降解菌降解活性成分分析 參考Guan等[37]的方法。挑取ZEN 降解菌單菌落于4 mL NB 培養(yǎng)基中,28℃、180 r·min-1預(yù)培養(yǎng)4 h,將1 mL 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至100 mL MM 中,28℃、180 r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將菌液4℃、5 000 r·min-1離心10 min 獲得胞外上清液和菌體細(xì)胞沉淀。將胞外上清液用無菌0.22 μm過濾器過濾,將沉淀的菌體用50 mmol·L-1PBS 緩沖液(pH 值7.4)清洗3 次后并用相同緩沖液重懸至細(xì)胞濃度為3 g·mL-1獲得菌體細(xì)胞。另準(zhǔn)備一份相同的菌體細(xì)胞用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)在冰上進(jìn)行破碎,超聲程序：輸出功率325 W；總工作時(shí)間25 min；工作/間歇時(shí)間為5 s/5 s,超聲后于4℃、12 000 r·min-1離心10 min,使用無菌0.22 μm 過濾器過濾上清液,得到細(xì)胞內(nèi)容物。

取5 μL 濃度為100 μg·mL-1的ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于10 mL 離心管中,加入985 μL 新鮮MM。加入10 μL 上述獲得的胞外上清液、菌體細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)容物,充分混勻后在28℃、180 r·min-1(旋轉(zhuǎn)半徑20 mm)條件下震蕩培養(yǎng)72 h,10 000 r·min-1離心10 min 去除細(xì)胞,收集上清液。對(duì)照組：取10 μL 50 mmol·L-1PBS加入體積為990 μL 的含5 μg·mL-1ZEN 的MM。然后按照1.3.2 的方法提取毒素,用于HPLC-FLD 檢測(cè),并計(jì)算ZEN 降解率。

1.3.6 ZEN 降解產(chǎn)物的提取和檢測(cè) 按1%接種量接種已培養(yǎng)好的ZEN 降解菌菌液至含有5 μg·mL-1ZEN的5 mL MM 中,28℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)36 h,8 000 r·min-1離心10 min,取2.5 mL 上清液用于提取降解產(chǎn)物。將5 mL 僅含有5 μg·mL-1ZEN 的MM 設(shè)為陽性對(duì)照,5 mL 僅含有NS2 的MM 設(shè)為陰性對(duì)照。

對(duì)于水溶性降解產(chǎn)物,樣品用乙腈-水(84∶16,v/v)萃取；對(duì)于水不溶性降解產(chǎn)物,用氯仿(1∶1,v/v)萃取。萃取完成后于氮吹儀干燥,用甲醇-水(7∶3,v/v)懸浮,并采用高效液相色譜與四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(high performance liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry,HPLC-QTOF-MS)進(jìn)行分析[38]。

LC 檢測(cè)條件：Agilent 1200 高效液相色譜儀,色譜柱Agilent Plus C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μm。流動(dòng)相A 為100%水,流動(dòng)相B 為100%乙腈。梯度洗脫程序?yàn)?～5 min,30%流動(dòng)相B；5～15 min,30%～50%流動(dòng)相B；15～30 min,50%流動(dòng)相B；30～36 min,90%流動(dòng)相B,36～37 min,90%～30%流動(dòng)相B；37～49 min,30%流動(dòng)相B。總運(yùn)行時(shí)間49 min,流速 0.2 mL·min-1,注射體積5 μL。柱溫30℃。

MS 檢測(cè)條件[39]：Agilent 6520 ESI-Q-TOF,電噴霧電離(ESI),毛細(xì)管電壓為3.5 kV,碎裂電壓為135Ⅴ,分離器為65 Ⅴ。脫溶劑氣體溫度為350℃,干燥氣體流速為9 L·min-1,霧化器為45 psi,碰撞氣為氮?dú)?。使用擴(kuò)展的動(dòng)態(tài)范圍和1.4 光譜/秒的掃描速率以及通過改變碰撞能量與質(zhì)量,檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM),掃描范圍為100～1 000 m/z。使用的數(shù)據(jù)站操作軟件是Mass Hunter(版本B.01.03)。

1.3.7 降解菌對(duì)受污染玉米中ZEN 的降解 從當(dāng)?shù)爻匈徺I玉米粒,測(cè)定其ZEN 含量。將玉米粒精細(xì)研磨,過20 目篩,取25 g 玉米粉于250 mL 三角瓶中滅菌,加入ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品,使其終濃度為2.5 mg·kg-1。每個(gè)三角瓶接種2.5 mL 預(yù)培養(yǎng)的ZEN 降解菌(2.5 mL NB 用于對(duì)照組)。28℃培養(yǎng)3 d 后,采用1.3.2 的方法提取和檢測(cè)ZEN 含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZEN 降解菌的篩選

從湖南等5 個(gè)地區(qū)的玉米、小麥、大麥樣品中共分離到108 個(gè)單菌落。采用HPLC 法,利用以ZEN 為唯一碳源的MM 對(duì)上述單菌進(jìn)行降解菌的篩選,獲得10株具有ZEN 降解效果的菌株,具體信息見表2。

由表2可知,菌株NS2 降解效果最好,其液相色譜圖如圖1所示,ZEN 經(jīng)降解菌NS2 于28℃、180 r·min-1處理72 h 后,在保留時(shí)間為7.6 min 時(shí)其特征性吸收峰明顯降低,經(jīng)計(jì)算后得出對(duì)照組中殘留ZEN含量為5.04 μg·mL-1,試驗(yàn)組中殘留ZEN 含量為0.20 μg·mL-1,降解率高達(dá)95.99%。因此選擇NS2 進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 ZEN 降解菌的鑒定

2.2.1 降解菌NS2 形態(tài)特征 降解菌NS2 在NA 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24 h 后,形成的單菌落類似圓形,邊緣不規(guī)則,有隆起,表面褶皺,不透明,干燥,菌落呈淺黃色,具體形態(tài)見圖2；顯微鏡下油鏡觀察(圖3),細(xì)胞呈桿狀,大小為(0.6～1.0)μm×(1.5～3.0)μm,革蘭氏染色陽性,產(chǎn)芽孢,芽孢呈橢圓形,有莢膜,周生鞭毛稀疏,初步判斷為芽孢桿菌。

2.2.2 降解菌NS2 生理生化特性 由表3可知,降解菌NS2 為嚴(yán)格好氧型細(xì)菌,能利用酪素、淀粉、明膠、吐溫、七葉苷、檸檬酸等,不能利用酪氨酸、脲酶等。

2.2.3 降解菌NS2 的16 SrDNA 鑒定 將擴(kuò)增出的16S rDNA 單一條帶進(jìn)行DNA 測(cè)序,序列長(zhǎng)度為1 452 bp,相應(yīng)的序列已提交至GenBank(序列登記號(hào)：KM096464),并保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心,編號(hào)：CGMCC9068。通過MEGA7.0 軟件構(gòu)建該菌株的16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹,根據(jù)形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定結(jié)果結(jié)合16S rDNA 序列分析,菌株NS2 被鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

表2 具有ZEN 降解作用的菌株信息Table 2 Strain information with ZEN degradation

圖1 NS2 對(duì)ZEN 的降解效果Fig.1 Degradation effect of NS2 on ZEN

圖2 降解菌NS2 形態(tài)特征圖Fig.2 Morphological characteristics of degrading bacteria NS2

圖3 油鏡顯微鏡下NS2 形態(tài)特征Fig.3 NS2 morphological characteristics under the microscope

表3 降解菌NS2 生理生化特性Table 3 Characteristics of strain NS2

圖4 基于16S rDNA 序列的菌株NS2 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain NS2 based on 16S rDNA sequence

2.3 菌株NS2 特性分析

2.3.1 菌株NS2 的抗菌活性 當(dāng)解淀粉芽孢桿菌NS2 與2 種病原菌指示劑大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌共培養(yǎng)時(shí),可觀察到清晰的抑制圈,表明NS2 可以抑制大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)(表4)。說明該菌具有良好的抗菌活性,具有保鮮防腐等應(yīng)用潛力和商業(yè)價(jià)值。

2.3.2 菌株NS2 的木聚糖、羧甲基纖維素酶、蛋白酶活性 在含有木聚糖,羧甲基纖維素的NA 培養(yǎng)基中未觀察到明顯的暈圈,說明菌株NS2 不產(chǎn)生木聚糖酶和羧甲基纖維素酶,但是在脫脂乳的NA 培養(yǎng)基上觀察到了清晰的暈圈(圖5),表明NS2 蛋白酶活性較高,這可能會(huì)在提高飼料利用率方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

表4 NS2 與病原菌指示劑共培養(yǎng)時(shí)的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect of NS2 when co-cultured with pathogen indicator /cm

2.4 菌株NS2 降解活性成分分析

將胞外上清液、菌體細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)容物分別與5 μg·mL-1ZEN 毒素在28℃、180 r·min-1共同孵育72 h,降解結(jié)果如圖6所示。其中,活的菌體細(xì)胞降解率為57%,細(xì)胞內(nèi)容物降解率為40.3%,而胞外上清僅為1.8%。由此可知,降解效果主要來自于活細(xì)胞產(chǎn)生的胞內(nèi)活性物質(zhì),胞外上清液幾乎沒有活性物質(zhì),推測(cè)該降解活性物質(zhì)可能無法分泌。

圖5 脫脂乳-NA 培養(yǎng)基上由NS2 產(chǎn)生的蛋白酶Fig.5 Protease production by NS2 Bacillus amyloliquefaciens in Skim milk-NA medium

圖6 菌株NS2 的不同組分對(duì)ZEN 降解率的影響Fig.6 The influence of different components of strain NS2 on ZEN degradation

2.5 ZEN 降解產(chǎn)物分析

為了檢測(cè)菌株NS2 降解ZEN 后的降解產(chǎn)物,將菌株接種到含有5 μg·mL-1ZEN 的MM 中,28℃孵育36 h 后,檢測(cè)降解率為43.3%。為減少溶劑極性對(duì)降解產(chǎn)物分析的影響,分別使用氯仿和乙腈2 種有機(jī)試劑提取水不溶性、水溶性降解產(chǎn)物,然后用HPLC-QTOF-MS 檢測(cè)。使用Mass Hunter 數(shù)據(jù)分析軟件的分子特征提取功能分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果如圖7、8所示,數(shù)據(jù)庫中未檢索到α -ZOL、β-ZOL 和其他有毒降解產(chǎn)物,初步判定ZEN 經(jīng)降解菌NS2 處理后代謝較完全,無有毒代謝物產(chǎn)生。

2.6 菌株NS2 對(duì)玉米粉中ZEN 的降解

向玉米粉中加入ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品,使其初始ZEN 濃度為2.5 mg·kg-1,按10%的接種量接種菌株NS2,28℃培養(yǎng)3 d 后,ZEN 降解率為88.2%,說明該菌在實(shí)際應(yīng)用基質(zhì)中具有高效的降解作用,為ZEN 降解菌制劑的開發(fā)與商業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

ZEN 生物消減技術(shù)主要是基于微生物產(chǎn)生的酶對(duì)ZEN 的高效降解作用,或微生物菌體對(duì)毒素的吸附作用,具有高效、特異、溫和、環(huán)境友好、不對(duì)產(chǎn)品造成營(yíng)養(yǎng)成分破壞等優(yōu)點(diǎn)。

益生菌是ZEN 降解微生物潛在的良好來源,除了能夠降解ZEN,降低其毒性外,還可以通過改善微生態(tài)平衡,與局部免疫系統(tǒng)細(xì)胞相互作用對(duì)宿主產(chǎn)生有利的影響。解淀粉芽孢桿菌是一種益生菌,是EFSA 認(rèn)定的安全菌株,可作為飼料添加劑使用。該菌幾十年來一直用于生產(chǎn)各種商業(yè)上重要的抑菌蛋白、脂肽類抗生素等代謝物,具有抑制病原微生物生長(zhǎng)、改善水質(zhì)、促進(jìn)飼料利用率等作用[40-41]。本研究觀察到NS2 在液體和固體培養(yǎng)基中均具有高效的ZEN 降解活性,同時(shí)還顯示出針對(duì)大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的抗微生物活性。若將該菌添加到飼料或飼料原料中,可在源頭上減少ZEN 毒素的危害,同時(shí)還可以通過產(chǎn)生蛋白酶等活性物質(zhì),改善飼料口味,促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,提高飼料的轉(zhuǎn)化率[42]。因此,解淀粉芽孢桿菌NS2 在降解真菌毒素的菌制劑的開發(fā)、應(yīng)用方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)和潛力。

微生物脫毒雖然可以有效降低食品或飼料中的ZEN 含量,但是經(jīng)過處理后,ZEN 的毒性是否能有效降低、是否會(huì)生成新的有毒產(chǎn)物等問題,一直都是科研工作者所關(guān)注的焦點(diǎn)。研究顯示,ZEN 可通過酮羰基還原的代謝方式生成α-ZOL 或β-ZOL,而α-ZOL 的雌激素毒性比ZEN 的還要高,約等于其二倍。因此不能僅依靠檢測(cè)ZEN 含量來衡量脫毒效果,需要同時(shí)檢測(cè)降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和雌激素毒性。潘麗婷等[43]篩選到了1 株對(duì)ZEN 有高效降解作用的解淀粉芽孢桿菌,但是未對(duì)降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、毒性進(jìn)行研究。而本研究通過HPLC-Q-TOF-MS 進(jìn)一步分析解淀粉芽孢桿菌降解ZEN 后的產(chǎn)物,未檢測(cè)到α-ZOL 或β-ZOL,也未觀察到其他有毒代謝產(chǎn)物。因此,解淀粉芽孢桿菌NS2 不是通過酮羰基還原這條途徑來降解ZEN 的。但ZEN降解產(chǎn)物的毒性還需要通過Ams 試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步深入分析。

圖7 用氯仿萃取的ZEN 降解產(chǎn)物的HPLC-Q-TOF-MS 譜Fig.7 HPLC-Q-TOF-MS spectra of ZEN degradation products extracted with chloroform

圖8 用乙腈萃取的ZEN 降解產(chǎn)物的HPLC-Q-TOF-MS 譜Fig.8 HPLC-Q-TOF-MS spectra of ZEN degradation products extracted with acetonitrile

4 結(jié)論

本研究從湖南省邵陽市采集的玉米中篩選分離到1 株ZEN 高效降解菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和16s rDNA 分子鑒定為解淀粉芽孢桿菌,該菌株是一種益生菌,能夠有效抑制病原菌大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng),同時(shí)還能分泌蛋白酶,在提高飼料利用率方面有巨大的潛力。該菌株在72 h 內(nèi)對(duì)5 μg·mL-1ZEN 的降解率高達(dá)95.99%,降解產(chǎn)物中未檢測(cè)到有毒的α-ZOL、β-ZOL 和其他有毒產(chǎn)物。解淀粉芽孢桿菌NS2 的發(fā)現(xiàn)為食品和飼料中玉米赤霉烯酮的去除提供了一種有效措施,為ZEN 解毒菌劑的開發(fā)與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。