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    刺梨中活性物質的提取與性能探討

    2020-07-01 14:59:20陳代秀夏偉麗胡思前郭艷華張玉敏
    化肥設計 2020年2期
    關鍵詞:刺梨蘆丁提取液

    陳代秀,夏偉麗,胡思前,郭艷華,張玉敏

    (江漢大學化學與環(huán)境工程學院,湖北 武漢 430056)

    隨著經濟的發(fā)展和人們物質生活水平的不斷提高,食品安全和環(huán)保已成為消費者最關心的問題。利用天然植物提取的無毒食用活性成分更是成為被追尋和探索的對象。許多研究表明,刺梨果實中含有大量黃酮、SOD、維生素、有機酸及抗壞血酸和多糖等成分,具有抗癌防癌、有抗氧化、增強免疫、抗突變、防治糖尿病、降低重金屬負荷等藥理作用[1]。刺梨中含有的具有藥理活性的黃酮類物質,可與超氧陰離子自由基反應來阻斷自由基引發(fā)的連鎖反應,與脂質過氧基反應來阻斷脂質過氧化進程等,還具有擴張冠狀動脈、消炎、調節(jié)血壓、保護心血管、解毒鎮(zhèn)靜、降血脂和抗腫瘤等重要的生物活性。刺梨活性成分不光對治療人體鉛中毒有特殊療效,對改善動脈粥樣硬化也有明顯作用[2]??梢?,刺梨不僅營養(yǎng)豐富,而且食用安全,所以在食品、保健品及藥品等方面具有巨大的開發(fā)前景。針對刺梨活性成分,許多研究者分別采取堿性水或堿性稀醇提取法、有機溶劑提取法、微波法、超聲波法、酶解法、水提法、大孔樹脂吸附法、超濾法、超臨界萃取法等提取,采用質譜、色譜等技術鑒定野生刺梨中的微量營養(yǎng)成分,并對其藥效、藥理進行研究[3]。

    本文采用有機溶劑浸提提取野生刺梨黃酮,結合單因素試驗對提取工藝進行優(yōu)化,探索提取刺梨中總黃酮的最佳工藝條件,探討刺梨中總黃酮的耐熱、耐光、抗氧化穩(wěn)定性[4-9],為深入開發(fā)利用刺梨資源、促進刺梨產業(yè)發(fā)展提供了一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑和儀器

    主要材料和試劑:刺梨干果(網(wǎng)售、河南省開封市),烘箱烘干,粉碎,放入保鮮袋中密封保存。

    乙酸、丙酮、乙酸乙酯 、石油醚、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、DPPH等,均為分析純。

    主要實驗儀器與設備:電子天平,上海精密科學儀器有限公司;中草藥粉碎機,天津市泰斯特儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋,國華電器有限公司;超聲波清洗儀,昆山市超聲波儀器有限公司;紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司。

    1.2 總黃酮含量的測定1.2.1 標準曲線的繪制

    精確稱取20.9 mg的蘆丁,用適量70%乙醇溶液溶解,再轉移到100 mL容量瓶中定容,即得濃度為0.020 9 mg/mL的蘆丁溶液。

    移取蘆丁標準溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6mL,分別置于25 mL具塞比色管中,各加入30%乙醇溶液體積為 6mL;然后加入0.75 mL的5%亞硝酸鈉溶液搖勻,靜置5min;加入0.75 mL的10%硝酸鋁溶液搖勻,靜置5min;加入5 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液,用30%乙醇溶液定容至刻度并搖勻,靜置10min。用紫外分光光度計以30%的乙醇為對照,以最大波長處測其吸光度。以吸光度為橫坐標,蘆丁標準溶液濃度為縱坐標,繪制標準曲線。

    1.2.2 提取條件探討

    (1)浸提劑的選取。準確稱取6份干燥刺梨干粉0.200 g,料液比為1∶100(g∶mL),分別加入乙酸乙酯、乙酸、丙酮、石油醚、乙醇等試劑,常溫下提取時間為1 h。分別得到幾種野生刺梨總黃酮提取液,在最大波長處測其吸光度,選取最佳浸提劑。

    (2)提取時間的選擇。準確稱取6份干燥刺梨粉M=0.200 g,料液比為1∶125,放入恒溫水浴鍋,設置溫度為25℃,提取時間分別為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h,過濾出的提取液體積為V1,然后取提取液濾液V2=1.4 mL,按測定蘆丁標準曲線中的方法測吸光度,從回歸方程中查出黃酮相應的濃度,計算出黃酮的提取率(Y=C×(V1/V2)/M),選擇最佳提取時間。

    (3)浸提劑濃度的選擇。準確稱取7份干燥野生刺梨粉0.200g,在上述最佳提取時間下,在料液比為1∶125時,放入恒溫水浴鍋,設置溫度為25℃,用濃度分別為35%、45%、55%、65%、75%、85%和100%(體積分數(shù),下同)提取劑浸泡刺梨粉,過濾,分別取V1=2 mL提取液,同樣方法測定吸光度,選擇最佳浸提濃度。

    (4)料液比的選擇。準確稱取5份干燥刺梨粉0.200 g,在上述最佳提取條件下,放入恒溫水浴鍋,設置溫度為25℃,在料液比分別為1∶100(g∶mL,下同),1∶125、1∶150、1∶175、1∶200,控制在最佳提取時間下,測定吸光度,選擇最佳的提取料液比。

    (5)提取溫度的選擇。準確稱取5份干燥野生刺梨粉0.200 g,在上述最佳浸提劑濃度、料液比條件下,提取時間為1 h,恒溫溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃,得到刺梨總黃酮提取液,測定吸光度,選擇最佳的提取時間。

    1.2.3 正交實驗

    根據(jù)單因素試驗結果,選擇浸提劑濃度(A)、浸提劑用量(B)、浸提時間(C)、浸提溫度(D)為影響因素,設計成L9(34)正交實驗(見表1),探討對總黃酮提取效果的最優(yōu)組合和因素的主次關系。

    表1 L9(34)正交實驗

    根據(jù)上述實驗結果,判斷各因素對野生刺梨中總黃酮提取率影響的大小,得出最優(yōu)方案,確定最佳工藝條件。

    1.2.4 總黃酮提取量的測定

    準確稱取干燥、粉碎、過40目篩的刺梨粉末0.200 g,按照上述最佳料液比、溫度、浸提劑濃度、浸提時間條件下提取,過濾去渣,得到刺梨總黃酮提取液。取提取液0.5 mL,按照前述方法測其吸光度值,依次測定5次,取平均值。從回歸方程中查出相應的黃酮濃度,計算刺梨總黃酮得率。

    按下式計算黃酮含量:

    Y=C×(V1/V2)/M

    式中,Y為黃酮含量(mg·g-1),C為測定液黃酮濃度(mg·L-1),V1為提取液體積(mL),V2為測量時取液體積(mL),M為提取時天然植物質量(g)。

    黃酮的提取率=黃酮含量(g)/天然植物皮粉末質量(g)。

    1.3 穩(wěn)定性探討

    (1)光照對刺梨黃酮穩(wěn)定性的影響:各取5組黃酮提取液10mL,放在紫外光燈下照射0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h后,測定在最大波長下吸光度的變化。

    (2)溫度對刺梨黃酮穩(wěn)定性的影響:各取5組黃酮提取液10mL,分別放在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的恒溫水浴鍋中各1 h,測定在最大波長下吸光度的變化。

    (3)刺梨黃酮提取液的抗氧化性:可用自由基的清除情況,來評價刺梨黃酮提取液的抗氧化能力。其抗氧化能力用抑制率來表示,抑制率越大,抗氧化能力越強。

    抑制率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%

    式中,Ai為加抗氧化劑后的DPPH溶液的吸光值;Aj為50%乙醇溶液和抗氧化劑混合后的吸光值;Ac為未加抗氧化劑的DPPH溶液的吸光值。

    2 結果與討論

    2.1 標準曲線的繪制

    通過文獻,波長在510 nm附近蘆丁和黃酮均有最大吸收波長。在實驗1.2.1的條件下,繪制蘆丁的標準曲線,蘆丁溶液濃度與吸光度的關系見圖1。

    圖1 吸光度與濃度的關系

    根據(jù)圖1不同濃度下的標準蘆丁溶液與其吸光度的關系,得出蘆丁的標準曲線方程,后續(xù)實驗的相關計算可以按照此方程進行計算。

    2.2 浸提劑的選取

    在1.2.2浸提劑的選擇實驗條件下,測量不同浸提劑提取出的提取液的吸光度,采用無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、乙酸分別浸提刺梨,分別測得浸提液的吸光度結果(見圖2)。

    圖2 浸提劑的選擇

    由圖2中可以看出,無水乙醇的浸提效果最好,其次是乙酸、丙酮。乙酸乙酯和石油醚的浸提效果很差,即無水乙醇為最佳的浸提劑,在后續(xù)的提取條件探討中均選擇無水乙醇作為浸提劑。

    2.3 提取時間的選擇

    根據(jù)1.2.2實驗中提取時間的選擇,在其他提取條件相同的前提下,改變提取時間,得出提取時間與提取率的關系(見圖3)。

    圖3 浸提時間的選擇

    由圖3可以看出,隨著浸提時間的延長,在0.5~1.5 h之間,提取率也隨之增大,并且提取率的上升幅度很大,但是在超過1.5h后,提取率隨提取時間的延長而減緩,且提取率隨著時間的延長開始緩慢地減小,然后慢慢趨于穩(wěn)定,變化幅度不大,由此可知,提取刺梨黃酮的最佳時間為1.5 h,在后續(xù)提取實驗中以此時間為標準進行。

    2.4 提取劑濃度的選擇

    根據(jù)1.2.2實驗中浸提劑濃度的選擇,在其他提取條件相同的前提下,改變浸提劑濃度,測量吸光度并計算不同浸提劑濃度下的提取率,同時繪制不同浸提劑濃度與其提取率的關系(見圖4)。

    圖4 浸提劑濃度的選擇

    由圖4可以看出,濃度為55%乙醇的提取效果最好,乙醇濃度低于55%時,測得的吸光度和計算的提取率隨濃度的增大而增大;乙醇濃度高于55%時,測得的吸光度和計算的提取率隨濃度的增大而減小,故選擇濃度為55%的乙醇為提取劑。

    2.5 料液比的選擇

    為測量料液比對刺梨黃酮提取效果的影響,根據(jù)1.2.2實驗中料比液的選擇,在其他提取條件相同、不同料液比的條件下,測量吸光度并計算不同料液比下的提取率,得出料液比與其提取率的關系(見圖5)。

    圖5 料液比的選擇

    由圖5可知,隨著乙醇料液比的增大,刺梨中黃酮的提取率隨之增大,當液料比低于1∶150(g∶mL)時,提取率的上升幅度大,當液料比高于1∶150(g∶mL)時,黃酮提取率的上升幅度變小并逐漸趨于穩(wěn)定,從節(jié)約浸提劑的角度考慮,故選擇液料比1∶150(g∶mL)為提取野生刺梨黃酮的最佳液料比。

    2.6 提取溫度的選擇

    根據(jù)1.2.2實驗中提取溫度的選擇,在其他提取條件相同、不同提取溫度的條件下,測量吸光度,并計算不同溫度下的提取率,繪制不同溫度與其提取率的關系(見圖6)。

    圖6 溫度的選擇

    由圖6可以看出,隨著溫度的升高,測得的吸光度和計算的提取率隨之增大,當溫度升高到40℃時,提取率達到最大,溫度再升高后吸光度呈下降趨勢。原因可能是隨著溫度的升高增加了黃酮的溶解度,同時提取液黏度減小,加快了黃酮的析出。當溫度過高時,可溶性蛋白質析出變性,黏度加大而影響細胞破裂,阻礙黃酮物質的析出。故40℃是提取野生刺梨黃酮的最佳溫度。

    2.7 正交實驗

    選擇用乙醇濃度A、浸提劑用量B、浸提時間C、浸提溫度D為影響因素設計成L9(34)正交實驗,具體情況見表2,實驗結果見表3。

    表2 L9(34)正交實驗

    表3 正交實驗L9(34)結果

    由表3可知,4種因素對野生刺梨中黃酮提取效果的影響主次因素順序為D、A、B、C,即溫度、濃度、料液比、時間。野生刺梨提取黃酮的最佳工藝為提取溫度30℃,乙醇濃度為45%,料液比為1∶175(g∶mL),提取時間為2h。由方差分析結果可知,溫度對提取液濃度的影響較大,時間對其的影響較小。由于實驗中各條件存在交互作用或者實驗誤差,所以需要作進一步的分析。在表3中,第3組實驗在9組中提取率最大,溫度與最佳提取溫度差異較大,所以需再次進行比較(見表4)。

    表4 溫度的影響

    由表4數(shù)據(jù)可知,溫度在40℃的時候提取率達到最大,也是探究的單因素最佳溫度,故刺梨提取總黃酮的最佳條件溫度是40℃,乙醇濃度是45%,料液比為1∶175(g/mL),提取時間為2h。

    根據(jù)正交試驗結果,在最佳條件測得的吸光度為0.407,代入前面標準曲線的回歸方程:

    Y=9.095 7X-0.021 9,并計算可得出提取液的濃度為6.468 mg/L,總黃酮提取率為28.29 %。

    2.8 提取液的穩(wěn)定性2.8.1 提取液耐光性的測定

    各取5組野生刺梨黃酮提取液10mL,在其他條件相同的情況下,放在紫外光燈下分別照射0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h后,再測量不同照射時間的吸光度,繪制不同照射時間及與其吸光度的關系(見圖7)。

    圖7 提取液的耐光性

    由圖7可知,隨著紫外光照時間的增長,提取液的吸光度明顯下降,可能是由于光照破壞了黃酮的結構,當時間超過1 h后吸光度又增加,可能是野生刺梨中的黃酮類物質分解成其他強吸收物質,影響吸光度,故刺梨中黃酮的耐光性較弱。

    2.8.2 提取液耐溫性的測定

    取5組刺梨黃酮提取液10 mL,分別放在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的恒溫水浴鍋各加熱1 h,測其吸光度,繪制不同溫度與其吸光度的關系(見圖8)。

    圖8 提取液的耐熱性

    由圖8可知,隨著溫度的提高,提取液的吸光度明顯下降,可能是由于高溫會破壞黃酮的結構,當溫度高于50℃后吸光度又增加,推測可能是野生刺梨中的黃酮類物質分解成其他強吸收物質影響吸光度,故野生刺梨中黃酮的耐熱性較弱。

    2.9 提取液的抗氧化性

    各取10 mL具塞比色管,編號為1、2、3,在1號中加入1 mL DPPH溶液,再加提取液定容,在2號中加入1 mL 50%乙醇溶液,再加提取液定容,在3號中加入1 mL DPPH溶液,再加50%乙醇溶液定容,提取液抗氧化性測定見表5。

    表5 提取液的抗氧化性

    由抑制率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100% 可得:

    抑制率=[1-(0.185-0.180)/0.022]×100%= 77.27%,由結果可以看出,野生刺梨中黃酮的抗氧化性較強。

    3 結語

    野生刺梨黃酮提取的最佳浸提劑是無水乙醇,最佳條件為提取溫度40℃、乙醇濃度45%、料液比1∶175(g∶mL)、提取時間2h。用正交實驗所得出的最優(yōu)條件下提取刺梨活性成分總黃酮,提取率為28.29%。野生刺梨中黃酮的耐熱性、耐光性較差,但抗氧化性較強。

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