基于COⅡ基因分析魯山柴雞遺傳多樣性

王蓮哲，白夢彩，毛 銳，李冰冰

(河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036)

地方家禽遺傳資源是生物多樣性的重要組成部分，是未來家禽品種改良和資源保護(hù)與持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)[1]。鳥類線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)具有母系遺傳、多態(tài)性高和不易發(fā)生重組等特性，線粒體相關(guān)基因作為分子標(biāo)記已被廣泛用于家禽物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)生、遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)等方面的研究[2-3]，如利用生物體線粒體DNA中一段保守片段作為DNA條形碼可以對物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定，較為常見的是線粒體CO I、COⅡ、ND1、Cytb等保守基因[4-7]。線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基II(COⅡ)基因中的部分區(qū)域由于變異速率適中及具有完善的通用引物，近年來被用作物種鑒定及群體遺傳進(jìn)化的理想分子標(biāo)記，在物種鑒定及遺傳進(jìn)化分析中發(fā)揮了重要作用[8]。

河南省魯山縣隸屬伏牛山脈，地處中原地區(qū)，氣候溫和、生態(tài)環(huán)境優(yōu)良。魯山本地柴雞由于地理環(huán)境因素造就生殖隔絕，長期進(jìn)化形成了一種穩(wěn)定遺傳的品系。魯山雞種適應(yīng)性強(qiáng)、抗病性強(qiáng)、耐粗飼，覓食能力強(qiáng)，蛋肉品質(zhì)優(yōu)良，作為地方品種是寶貴而重要的遺傳資源。本研究以魯山本地柴雞為研究對象，分析線粒體COⅡ基因序列堿基組成和多態(tài)性，并構(gòu)建魯山雞和其他雞種的系統(tǒng)發(fā)育樹，探討分析魯山雞遺傳起源及遺傳多樣性特點(diǎn)，為地方雞品種資源保護(hù)和開發(fā)利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機(jī)選取平頂山市魯山縣柴雞36只，翅下靜脈取血。血樣采集后添加抗凝劑，用血液DNA提取試劑盒(天根生化)提取全基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank公開發(fā)表的紅色原雞COⅡ基因序列設(shè)計合成引物，上游COⅡ-F：CCACTCCCAACTAGGCTTTC，下游COⅡ-R：GACAGTAGTGAGGATCAG，引物由武漢金開瑞生物公司合成。PCR反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃，3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸60 s，34個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。片段大小669 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，樣品送武漢金開瑞生物公司測序。

1.3 統(tǒng)計與分析

測序結(jié)果通過軟件Bioedit讀取，雙向測序校正及人工逐堿基校對。從NCBI數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)雞種COⅡ基因，使用Clustal_X進(jìn)行序列比對，MEGA6.0[9]軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，1 000次自舉檢驗(yàn)。用DnaSP 6.0定義單倍型，同時計算核苷酸差異均數(shù)、核苷酸多樣性、單倍型多樣性及核酸變異位點(diǎn)數(shù)等。應(yīng)用Network 5.0構(gòu)建中介網(wǎng)絡(luò)圖(median-joining)[10]。

圖1 COⅡ基因PCR擴(kuò)增圖

2 結(jié)果與分析

2.1 COⅡ基因序列擴(kuò)增

魯山雞隨機(jī)取樣翅下靜脈取雞血，用試劑盒提取雞血總DNA，并用特異性引物擴(kuò)增COⅡ基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖1結(jié)果顯示：COⅡ基因條帶單一，片段大小在660 bp左右，符合預(yù)期。重復(fù)PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送公司測序。

2.2 魯山雞COⅡ基因序列分析

經(jīng)過PCR擴(kuò)增及測序校對，剔除首尾部分低質(zhì)量序列，得到CO Ⅱ序列570 bp進(jìn)行分析。魯山雞群體CO Ⅱ全序列變異區(qū)在26～570 bp，共發(fā)現(xiàn)16處多態(tài)位點(diǎn)，分別為26、36、72、96、112、114、146、181、191、354、358、393、462、471、569、570位點(diǎn)，占分析位點(diǎn)總數(shù)的2.81%，均為簡約信息位點(diǎn)。堿基組成分析顯示4種堿基含量分別為22.7%(T)、33.1%(C)、29.9%(A)和14.3%(G)，其中A+T含量(52.6%)稍高于G+C含量(47.4%)，基本保持平衡。變異類型轉(zhuǎn)換7處，顛換9處。16個多態(tài)位點(diǎn)界定為7個單倍型，分別為Hap1-Hap7。其中，單倍型Hap1有18個個體，占50%，為優(yōu)勢單倍型；單倍型Hap2、Hap3、Hap6各有4個個體；單倍型Hap4、Hap5、Hap7各有2個個體(見表1)。

表1 魯山雞COⅡ基因多態(tài)位點(diǎn)及單倍型

2.3 魯山雞單倍型網(wǎng)絡(luò)

基于中間連接法構(gòu)建的魯山雞CO Ⅱ 序列單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)，各單倍型以H1為中心，連接形成星狀發(fā)散(star-shape)結(jié)構(gòu)。其中，單倍型H1為優(yōu)勢單倍型，單倍型H2和H7遺傳距離較遠(yuǎn)，H3、H4、H5、H6與H1遺傳較近。核苷酸多樣性為0.004 41，單倍型多樣性為0.724。群體擴(kuò)張的Tajima′s D數(shù)據(jù)為-1.142 13，該數(shù)據(jù)未達(dá)到顯著水平，說明該群體依然符合中性選擇，未經(jīng)歷大規(guī)模的種群擴(kuò)張。

圖2 魯山雞單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

2.4 魯山雞系統(tǒng)發(fā)育分析

基于魯山雞線粒體COⅡ基因序列分析，將魯山雞7種單倍型與NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的其他雞種的COⅡ基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖3)。結(jié)果顯示：魯山雞7種單倍型聚在一類，且與原雞印尼亞種聚為一類，說明其有更近的親緣關(guān)系，在魯山雞進(jìn)化過程中，原雞印尼亞種貢獻(xiàn)較大。

圖3 魯山雞COⅡ基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性形成的基礎(chǔ)，是物種或其群體持續(xù)生存和環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果[11]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，正確認(rèn)識和評價不同農(nóng)副產(chǎn)品的遺傳多樣性水平，是開展保護(hù)及可持續(xù)開發(fā)利用的基礎(chǔ)。魯山雞作為平頂山本地的特色品種，其養(yǎng)殖與資源綜合利用是當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支撐。通過分子標(biāo)記研究地方雞種遺傳多樣性有助于當(dāng)?shù)靥厣锓N資源的保護(hù)與開發(fā)。以往有關(guān)雞線粒體遺傳多樣性的研究主要集中在CO I基因[12-14]，雞COⅡ基因研究少有報道。而COⅡ基因作為新開發(fā)的分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于其他物種鑒定[15-16]。本研究中基于線粒體COⅡ基因序列分析，對魯山雞遺傳多樣性和遺傳進(jìn)化進(jìn)行了分析。COⅡ基因擴(kuò)增片段長度為570 bp，4種堿基含量中A+T含量(52.6%)稍高于G+C含量(47.4%)，基本保持平衡，表明該基因堿基和密碼子的使用沒有一定的偏向性。36只個體共發(fā)現(xiàn)16處單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，7種單倍型，變異類型轉(zhuǎn)換7處，顛換9處，基本平衡。結(jié)果表明CO Ⅱ基因比較保守，序列分析區(qū)分度較高，可以作為分子標(biāo)記進(jìn)行雞種品種鑒定及多樣性分析。

隨著對外交流的日益頻繁，魯山雞群體亂雜態(tài)勢加劇，魯山雞作為地方品種其遺傳多樣性沒有分析報道，其遺傳進(jìn)化特點(diǎn)也不明確，因此保護(hù)不力。本研究顯示，魯山雞核苷酸多樣性為 0.004 41，每位點(diǎn)核苷酸多態(tài)性指數(shù)0.006 77，平均核苷酸差異2.514。單倍型多樣性為0.724，結(jié)果表現(xiàn)出魯山雞具有較高的遺傳多樣性[17]。該雞種Tajima′s D數(shù)據(jù)為-1.142 13，不顯著，說明該群體依然符合中性選擇，未經(jīng)歷大規(guī)模的種群擴(kuò)張[18]。

構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹是追溯物種起源的良好方法。壩上長尾雞用此方法分析表明，追溯其與中國原雞親緣關(guān)系最近，中國原雞對壩上長尾雞進(jìn)化起到重要作用[19]。系統(tǒng)進(jìn)化顯示茶花雞祖先可能為紅色原雞，主要貢獻(xiàn)為原雞滇南亞種[20]。單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系結(jié)果顯示，魯山雞7個單倍型以單倍型Hap1為優(yōu)勢類型，除單倍型Hap2和Hap7進(jìn)化距離稍遠(yuǎn)，其他單倍型進(jìn)化距離近。系統(tǒng)進(jìn)化分析，7個單倍型均聚于一個分支，且與原雞印尼亞種有更近的親緣關(guān)系。由此可見，魯山雞在長期的形成過程中其母系起源較為簡單，其祖先可能為紅色原雞，主要貢獻(xiàn)為原雞印尼亞種。

4 結(jié)論

以魯山本地柴雞為對象，利用線粒體基因COⅡ序列，通過測序及比較分析，研究了該序列的核苷酸多態(tài)性、單倍體多態(tài)性、群體間的遺傳多樣性、魯山雞與其他雞種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明：魯山雞核苷酸多樣性為 0.004 41，單倍型多樣性為0.724，表現(xiàn)出魯山雞具有較高的遺傳多樣性。魯山雞祖先可能為紅色原雞，進(jìn)化過程主要貢獻(xiàn)為原雞印尼亞種。