黃赭色鏈霉菌11F發(fā)酵工藝及其對黃瓜幼苗生長的影響

張濤濤，張 虹，趙 娟，田兆豐，吳慧玲

(北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097)

黃瓜枯萎病是一種土傳真菌病害，在設(shè)施黃瓜栽培中比較常見且危害嚴(yán)重[1]。黃瓜枯萎病是一種由半知菌亞門鐮孢屬尖孢鐮刀菌黃瓜?；虵usariumoxysporumf.sp.cucumebriumOwen侵染引起的土傳真菌病害[2]，生產(chǎn)上主要以化學(xué)防治為主。應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥雖然有一定的防治效果，但存在抗藥性、易殘留、環(huán)境及土壤污染等問題。相比之下，生物防治技術(shù)有著安全、無毒、環(huán)保等特點(diǎn)，利用以菌治菌的方法達(dá)到黃瓜枯萎病的防治，是較為理想的方法。目前，在黃瓜枯萎病的生物防治應(yīng)用中最為廣泛的有木霉屬、假單胞菌屬、芽胞桿菌屬等[3]。陳香等[4]研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)發(fā)酵菌液對黃瓜枯萎病有較強(qiáng)的抑菌活性，防治效果達(dá)到50.46%。谷祖敏等[5]采用拌土法接種長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)THLJ對黃瓜枯萎病的防效為67.05%。

鏈霉菌是最高等的革蘭氏陽性放線菌，主要分布于土壤中，能夠產(chǎn)生多種具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，大多數(shù)鏈霉菌具有拮抗、競爭和誘導(dǎo)作用，從而可以有效地防治植物病害[6]。鏈霉菌防治植物病害的機(jī)制主要包括誘導(dǎo)抗性、拮抗作用和競爭作用等[7-10]。鏈霉菌在抑制病原菌的同時也會誘導(dǎo)植物的抗性反應(yīng)，刺激植物產(chǎn)生抗病活性物質(zhì)，增強(qiáng)植物整體防御機(jī)能，通過分泌生長激素物質(zhì)促進(jìn)植物自身生長，間接提高植物抗病性。人們在開發(fā)鏈霉菌強(qiáng)大的抗菌代謝產(chǎn)物的同時，很大程度上忽略了鏈霉菌本身具有的產(chǎn)孢量大、孢子存活時間長且容易在土壤中定殖的優(yōu)點(diǎn)。目前中國關(guān)于鏈霉菌生物防治的研究，大部分集中在其代謝產(chǎn)物方面，如蘇道拉呼等[11]研究表明，鏈霉菌S1發(fā)酵液能夠抑制多種病原菌及根結(jié)線蟲，路丹丹等[12]研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌 M527 發(fā)酵液對黃瓜枯萎病原菌有拮抗作用。關(guān)于鏈霉菌通過產(chǎn)生抗生素和酶類活性物質(zhì)抑制病原菌的報道較多[13-14],而生防鏈霉菌活菌制劑通過在植物體內(nèi)或體表定殖，優(yōu)先占據(jù)生態(tài)位而抑制病原菌的系統(tǒng)研究很少，利用鏈霉菌活菌制劑防治黃瓜連作病害的效果、可行性及應(yīng)用前景評價的研究也較少，影響了鏈霉菌在生物防治上的應(yīng)用。同時目前關(guān)于鏈霉菌的活菌制劑產(chǎn)品目前市場上也非常少。比較成熟的產(chǎn)品僅有中國的細(xì)黃鏈霉菌(5406抗生菌)和芬蘭的Mycostop殺菌劑(灰綠鏈霉菌)[14]。黃赭色鏈霉菌11F是本課題組近年分離自青海湖附近植被根系土壤的一株對黃瓜枯萎病病原菌有較好抑制作用的菌株。擬優(yōu)化該菌株的固體發(fā)酵工藝，并進(jìn)行了固體菌劑對黃瓜生長及黃瓜枯萎病防效的研究。為開發(fā)鏈霉菌活菌制劑、減少化學(xué)農(nóng)藥使用、發(fā)展綠色環(huán)保生物防治技術(shù)提供可行性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

(1)高氏Ⅰ號培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)參照文獻(xiàn)[15]配制。種子培養(yǎng)基：蔗糖15 g，甘油1.5 mL，蛋白胨40 g，KH2PO40.5 g，CaCO30.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO40.5 g，1 000 mL蒸餾水。

(2)供試黃赭色鏈霉菌Streptomycessilaceus11F(CGMCC 14567)由本實(shí)驗室分離自青海湖附近植被土壤中。

(3)病原真菌為尖鐮孢菌黃瓜?；虵usariumoxysporumf.sp.cucumebriumOwen由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所。

1.2 菌株固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

選7～10 d PDA培養(yǎng)基上生長良好的適量11F的孢子，接種于種子培養(yǎng)基中，28 ℃ 220 r/min培養(yǎng)一定時間后接種于固體培養(yǎng)基中。

1.2.1 固體發(fā)酵基質(zhì)的篩選

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)有大米、小米、玉米粉、麩皮、蛋白胨等。供試處理為80%的大米+10%麥麩，70%的大米+20%麥麩，80%的小米+10%麥麩，70%的小米+20%麥麩，四個處理中每個處理加2%的蛋白胨和8%的玉米粉。

保持其他條件完全一致，分裝于500 mL燒杯中，121 ℃高溫滅菌40 min，每個處理3次重復(fù)，28 ℃條件下培養(yǎng)10 d后采用平板稀釋法測定不同處理的活菌數(shù)，確定最優(yōu)固體發(fā)酵基質(zhì)配比。

1.2.2 固體發(fā)酵種齡確定

將培養(yǎng)24、48、60、72、96 h的種子液，采用一致的接種量(8%)接種到固體培養(yǎng)基中，設(shè)3次重復(fù)，在28 ℃下培養(yǎng)7 d后，取出發(fā)酵產(chǎn)物置于35 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥，當(dāng)含水量低于2%時用打碎機(jī)打碎，磨成菌粉，取1 g菌粉溶于10 mL無菌水中用平板稀釋法測定含菌量。

1.2.3 最適接種量確定

接種量設(shè)置為5%、10%、15%、20%、25%，在28 ℃培養(yǎng)7 d后測定接種量對產(chǎn)孢的影響，3個重復(fù)，測定方法同1.2.2節(jié)。

1.2.4 固態(tài)基質(zhì)含水量

根據(jù)已經(jīng)確定的培養(yǎng)基質(zhì)為麩皮+大米+玉米粉+蛋白胨，設(shè)四個加水量梯度，基質(zhì)與水的比例分別為1∶0.3、1∶0.5、1∶0.7、1∶0.9，攪拌均勻后，121 ℃濕熱滅菌40 min后，每個處理重復(fù)3次，接入種子液后，28 ℃培養(yǎng)。7 d后取出培養(yǎng)物于35 ℃恒溫鼓風(fēng)烘干，方法同1.2.2節(jié)。

1.3 載體的篩選

1.3.1 載體對不同耐熱力的影響

將殼聚糖、非耕作土、輕質(zhì)鈣與菌粉1∶1比例混勻，放到54 ℃烘箱中，以不加載體菌劑為對照，每個處理重復(fù)3次，一周后取樣，分別取1 g放于10 mL離心管中，在振蕩器上混勻之后，采用平板稀釋法測定各菌體的存活率。

1.3.2 載體對抗紫外作用的影響

將菌粉與各載體1∶1分別混合均勻后，各稱取10 g分別于一次性培養(yǎng)皿中，置于312 nm紫外燈下照射過夜，以不加載體菌劑為對照，每個處理重復(fù)3次，測定載體對菌體的抗輻射能力。

1.4 菌劑11F對黃瓜促生及防治黃瓜枯萎病的研究

1.4.1 育苗

將黃瓜種子(京研綠秀F1)依次用75% 酒精浸泡10 min、無菌水洗凈、1% 次氯酸鈉浸泡5 min、用無菌水清洗3～4次，至包衣顏色褪去，之后放入墊有濾紙片的無菌培養(yǎng)皿上，添加無菌水，26 ℃過夜催芽。將露白的種子播入育苗盤中，長至二葉一心時移栽到盆缽。

1.4.2 促生試驗

調(diào)整固體菌劑孢子數(shù)為2×108cfu/g 活菌數(shù)，待黃瓜幼苗移栽期按照菌劑與蛭石比例1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120混勻，以不加菌粉只有蛭石為對照，每個處理15盆，定期澆水。

1.4.3 防病試驗

將平板培養(yǎng)8～10 d的尖鐮孢菌黃瓜?；凸蜗聛?，用無菌水稀釋成濃度為1×108cfu/mL的病原菌孢子懸浮液，備用。挑選長勢一致的黃瓜幼苗采用灌根法進(jìn)行盆栽試驗，接種方法：于黃瓜幼苗莖基部兩側(cè)4 cm處，用酒精滅過的刀片進(jìn)行傷根處理后，移栽到大小為6.5 cm×6.5 cm的盆缽中，每盆1株，同時在每株幼苗根莖部加入2 mL相應(yīng)的接種液。試驗設(shè)5個處理，處理如下：①清水澆黃瓜幼苗根部作為空白對照；②病原菌孢子液接種到黃瓜幼苗根部；③放置半年以上的11F菌劑接種于黃瓜幼苗根部；④同時接種病原菌孢子液與11F菌劑；⑤同時接種病原菌孢子液與50%多菌靈可濕性粉劑800倍稀釋液。每個處理20株，試驗重復(fù)三次，參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行發(fā)病植株調(diào)查，并用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 固體發(fā)酵基質(zhì)的篩選

培養(yǎng)基質(zhì)的篩選(表1)是固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵因素，試驗結(jié)果表明，生防放線菌11F在不同處理的基質(zhì)中都能生長，但是生長情況不同，在配比為80%大米+10% 麥麩的處理中生長最好，顯著高于其他處理(P<0.05)，處理80%小米+10%麥麩和處理70%大米+20% 麥麩間差異不顯著(P>0.05)，而與70%小米+20%麥麩差異顯著(P<0.05)，因此80%大米+10%麥麩更適合該菌株發(fā)酵。

表1 菌株11F的固體發(fā)酵基質(zhì)篩選Table 1 Screening of solid fermentation substrate for strain 11F

注：表中同一列數(shù)據(jù)含有不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.1.2 菌株11F固體發(fā)酵種齡和接種量確定

試驗結(jié)果如表2所示，表明接種量為10%、種齡為60 h時接種固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基效果最好，接種量過大或過小都不利于孢子達(dá)到最高生長量。而種齡小于60 h會造成固體培養(yǎng)周期長，容易污染。種齡過長，菌體生長進(jìn)入衰退期，菌體老化，活力降低，不利于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。

表2 種子液的種齡和接種量對11F固態(tài)發(fā)酵的影響Table 2 Effect of the seed liquid age and the inoculation amount on strain 11F

注：CFU為單位體積中細(xì)菌、霉菌、酵母等微生物的群落總數(shù)。

2.1.3 固態(tài)發(fā)酵水量確定

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)過程中，料水比是一個影響固體發(fā)酵的重要因素，濕度太大容易滋生細(xì)菌污染且透氣性差不利于菌株的產(chǎn)孢，影響發(fā)酵效率，濕度過小使發(fā)酵速率緩慢，從表3可以看出，不同料水比之間差異顯著(P<0.05)，當(dāng)料水比為1∶0.3生長效果與產(chǎn)孢量明顯好于其他處理，因此選擇與發(fā)酵基質(zhì)物質(zhì)比為1∶0.3最佳配水比。

表3 料水比對菌株11F固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of water proportion on output of strain 11F

2.2 載體的篩選

2.2.1 載體對不同耐熱力的影響

農(nóng)藥熱儲穩(wěn)定性測定方法中介紹，一般認(rèn)為54 ℃ 貯存1周，50 ℃ 儲存2周，40 ℃ 貯存8周大體為常溫貯存一年的結(jié)果[17]，11F與載體在54 ℃熱貯存7 d后，活菌數(shù)發(fā)生了不同的變化，由表4可以看出，殼聚糖對菌劑的保護(hù)作用最好，加殼聚糖其存活率只減少了14.6%，與其他處理差異顯著(P<0.01)，其次為非耕作土，而輕質(zhì)鈣沒有保護(hù)作用。

經(jīng)高溫?zé)崽幚砗?，殼聚糖和非耕作土的保護(hù)作用顯著，經(jīng)7d熱處理后存活率分別比對照的處理高50.1%、14.3%，輕質(zhì)鈣的存活率顯著低于對照(P<0.01)。

耐熱力體現(xiàn)了菌株對干熱的忍受程度，從而反映了載體對菌株的保護(hù)程度，試驗結(jié)果表明殼聚糖比非耕作土能更有效的起保護(hù)作用。

表4 載體對菌株11F的耐熱力的影響Table 4 Effect of carrier on heat tolerant ability of strain 11F

2.2.2 載體對抗紫外作用的影響

合適的載體能夠分散紫外輻射從而使菌體生存環(huán)境優(yōu)化[18]，試驗結(jié)果如圖1所示，由對照處理在紫外處理20 h后活菌量急劇下降，而在添加載體的菌粉中，在20 h其保護(hù)效率都大于80%，隨著紫外照射時間增多，每個處理的保護(hù)效率都有一定程度的下降，但殼聚糖的保護(hù)效率一直高于非耕作土與輕質(zhì)鈣，在這3種載體中，輕質(zhì)鈣的保護(hù)效率比起其他兩種載體較低，60 h時各種處理的保護(hù)效率下降程度較大，在照射100 h后，殼聚糖、非耕作黃土、輕質(zhì)鈣的保護(hù)效率分別為47.67%、37.33%、26.00%，結(jié)果表明，3種載體在紫外照射下對菌劑都有保護(hù)作用，殼聚糖的保護(hù)作用最好。

圖1 3種載體對菌劑11F的保護(hù)效率Fig.1 The anti-ultraviolet efficiency of fillers for 11F

2.3 促生、防病試驗

2.3.1 11F菌劑的促生作用

對11F菌劑進(jìn)行了不同劑量促生作用的研究，結(jié)果如表5所示，1∶100的菌劑株高、根長、鮮重、干重都顯著好于其他處理，株高增加39%，根長增加了33.9%，鮮重增加了35.3%，干重增加了40.9%，并且長勢茂盛，葉色濃綠，表明1∶100處理有顯著促生作用(P<0.05)，而1∶40的處理顯著低于對照(P<0.05)，對幼苗生長有抑制作用。不同濃度處理對株高的影響中，1∶100比例顯著高于其他處理，比對照高39%，而1∶120，與對照組之間無明顯差異(P>0.05)。不同處理根長也顯示同樣的結(jié)果，而鮮重結(jié)果1∶80與1∶120處理間差異不顯著(P>0.05)，其他各個處理間都差異顯著。干重結(jié)果1∶80與1∶100無顯著差異，1∶120時干重增幅最大，綜合整體指標(biāo)表明，1∶120時最適合菌株生長，而且促生效果明顯。

2.3.2 11F菌劑的防病作用

由表6可以看出，菌劑11F與菌劑11F+載體處理與對照組間差異顯著(P<0.05)，說明菌劑11F本身對防治黃瓜枯萎有明顯的效果，菌劑11F的防效為42.33%，菌劑11F+載體的防效為73.45%，加載體的防效明顯高于不加載體的，且這兩種處理間也差異顯著，說明載體對菌劑儲存有保護(hù)作用，都使防治效果得到顯著提高，由此進(jìn)一步說明了菌株11F作為活菌制劑，可用于黃瓜枯萎的防治。

表5 不同濃度菌劑對黃瓜生長發(fā)育的影響Table 5 Effects of different concentration of 11F on the growth and development of cucumber

表6 不同菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果Table 6 Control effect of different bacterial agents on fusarium wilt of cucumber

3 討論

生物防治因其環(huán)保、高效等特點(diǎn)大量被采用，生防菌劑的研制越來越受到人們的重視，目前，能夠大量生產(chǎn)的生防菌劑產(chǎn)品不多，運(yùn)用較多的一般為生防菌的次級代謝產(chǎn)物，將生防菌劑運(yùn)用到實(shí)踐中是以后生防微生物的發(fā)展方向。

在生防菌開發(fā)方面，固態(tài)發(fā)酵比液態(tài)發(fā)酵有更突出的優(yōu)勢[19]，固態(tài)發(fā)酵放線菌一般在含水量較低的環(huán)境中生存，生防菌固態(tài)發(fā)酵是指含水量較少但能夠滿足微生物代謝生長的固態(tài)基質(zhì)的發(fā)酵過程。優(yōu)良的固體培養(yǎng)基是固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵，而且影響著菌株的產(chǎn)量與質(zhì)量。固態(tài)發(fā)酵麩皮的加入有利于增強(qiáng)放線菌的通氣性，而且不易結(jié)塊，但是單純使用麩皮為基質(zhì)是不可行的，因為麩皮缺乏營養(yǎng)物質(zhì)的供給，不利于放線菌生長，所以在這基礎(chǔ)上添加玉米粉補(bǔ)充碳源，加蛋白胨補(bǔ)充氮源等，有些研究人員考慮將固態(tài)培養(yǎng)基中加入微量的磷酸鹽、鈣鹽等[20]，使培養(yǎng)基營養(yǎng)充分，從而發(fā)酵完全。試驗中菌株11F更偏好在大米上生長，再加上輔助的碳源氮源構(gòu)成比較合理的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。固態(tài)發(fā)酵種齡、接種量的確定也是固態(tài)發(fā)酵的重要影響因子，當(dāng)種子液生長活力正好在對數(shù)期時，利于固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)孢，如果種子液過了種齡菌體生長的對數(shù)期進(jìn)入衰退期，活力與代謝都下降，從而影響固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)量。接種量也是如此，適宜的接種量有利用其與基質(zhì)充分接觸，使種子液的利用率增加，如果接種量小會延長固態(tài)發(fā)酵的時間，容易使雜菌侵入，使發(fā)酵產(chǎn)量下降，而接種量過大使固體培養(yǎng)基濕度過大，容易滋生細(xì)菌。放線菌菌劑的開發(fā)還需要注意的就是儲存期的問題，在實(shí)際的生防應(yīng)用中，高溫、紫外照射都會破壞菌劑中的孢子數(shù)，添加載體能有效保護(hù)菌劑的貨架期，從3種載體中選出一種最適合菌株11F的載體殼聚糖能夠有效延長其儲存期。

采用溫室盆栽法對菌株11F的活菌劑做防病促生試驗，結(jié)果表明菌劑11F有很好的促生效果，對黃瓜的根長、干重、鮮重等多項指標(biāo)都有顯著的促生作用，且對黃瓜枯萎病的防效達(dá)73.45%，后期的研究表明菌株11F合成吲哚乙酸(IAA)產(chǎn)量較高。研究表明在牛毛草長勢旺盛，分離其根際土壤的菌株中有10%左右的菌株能產(chǎn)生IAA[21]，有的微生物能夠分泌鐵載體從而促進(jìn)植物對鐵的吸收，或者與病原真菌競爭鐵從而降低病原菌競爭力。僅對菌劑的研制及溫室防病促生試驗，未進(jìn)行大量的田間防效，確定菌劑在復(fù)雜的田間條件下防效的發(fā)揮程度及穩(wěn)定性，能夠提高生防菌的防病效果以及其市場化程度。

4 結(jié)論

為了深入研究黃赭色鏈霉菌11對黃瓜生長及黃瓜枯萎病的防治效果，對菌株11F的固體發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并研究了活菌劑對黃瓜生長的影響及對黃瓜枯萎病的防治效果。得到的優(yōu)化的固體發(fā)酵工藝條件為：基質(zhì)配比80%大米+10%麥麩，料水比為1∶0.3，最佳種齡為60 h，最佳接種量為10%。溫室盆栽實(shí)驗顯示菌劑11F (2×108cfu/g)與蛭石的比例為1∶100時黃瓜幼苗的株高、根長、鮮重、干重都顯著好于其他處理，株高增加39%，根長增加了33.9%，鮮重增加了35.3%，干重增加了40.9%，其長勢茂盛，葉色濃綠，促生效果明顯。菌劑11F對黃瓜枯萎有明顯的防治效果，防效為42.33%，菌劑11F加載體的防效為73.45%，加載體的防效明顯高于不加載體的，且這兩種處理間差異顯著，說明載體對菌劑儲存有保護(hù)作用，使防治效果得到顯著提高，由此進(jìn)一步說明了菌株11F作為活菌制劑，可用于黃瓜枯萎的防治。