Fc 受體樣4 蛋白在唾液腺黏膜相關(guān)淋巴組織結(jié)外邊緣區(qū)B 細胞淋巴瘤中的表達及意義

顧 挺， 張春葉， 胡宇華， 夏榮輝， 田 臻， 王麗珍， 李 江

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔病理科，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011）

黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）結(jié)外邊緣區(qū)B 細胞淋巴瘤屬于成熟B 細胞淋巴瘤的一種亞型，好發(fā)于胃、腸、唾液腺、淚腺及甲狀腺等部位。 不同部位的腫瘤，致病原因有所不同，如胃腸MALT 淋巴瘤常與幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染有關(guān)[1]，甲狀腺、唾液腺、淚腺的病變常與免疫性疾病有關(guān)[2]。與唾液腺MALT 淋巴瘤相關(guān)的免疫性疾病主要為Sjogren 綜合征（Sjogren syndrome，SS），少數(shù)為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡[3]等。 唾液腺MALT 常在淋巴上皮病的基礎(chǔ)上形成，與上皮關(guān)系密切，但目前對該腫瘤中B 細胞亞群的研究較少。

Fc 受體樣4（FCRL4）位于染色體1q21，屬于細胞膜上的跨膜蛋白受體家族， 主要表達在記憶B淋巴細胞的表面，參與免疫調(diào)控。 在健康個體中，其主要存在于扁桃體隱窩上皮附近[4]，與上皮關(guān)系密切。 近年來的報道發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CRL4 蛋白在邊緣區(qū)淋巴瘤中有較高的表達，被認為是一個較有價值的診斷性標(biāo)記物[5]。BLEL 作為唾液腺MALT 淋巴瘤的前驅(qū)病變，其基本構(gòu)成為淋巴組織和增生上皮島。 有研究報道，表達FCRL4 的B 淋巴細胞（FCRL4+的B 淋巴細胞）與BLEL 中淋巴上皮結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)[6]，提示FCRL4+的B 淋巴細胞與病變發(fā)生有一定關(guān)系。 MALT 淋巴瘤病變發(fā)生早期，腫瘤細胞總是位于增生上皮島內(nèi)或緊鄰上皮島的周邊，F(xiàn)CRL4+B 淋巴細胞在其中所起的作用還不得而知， 目前尚未見大樣本唾液腺MALT 淋巴瘤中FCRL4 表達狀況的研究。 本研究應(yīng)用IHC 法檢測MALT 淋巴瘤中FCRL4蛋白的表達，初步探討其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本來源及制備

從上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔病理科病例庫中篩選2005—2013 確診為唾液腺MALT 淋巴瘤的病例，收集患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、是否合并SS等， 參考第8 版《美國AJCC 癌癥分期手冊》 中的Lugano 分類法進行臨床分期[7]，并對患者進行隨訪。同時， 隨機選取10 例唇腺BLEL、20 例大唾液腺BLEL、30 例頜面部DLBCL 作為對照組。 所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)HE 染色。 所有唾液腺MALT 淋巴瘤病例均經(jīng)2 位高年資病理科醫(yī)師復(fù)片，診斷依據(jù)《WHO 頭頸腫瘤分類》（第4 版）[8]。HE 染色見淋巴上皮病上皮島內(nèi)及上皮周邊少量較一致的小至中等大小的淋巴細胞浸潤，腫瘤淋巴細胞IHC 染 色 表 達B 細 胞 標(biāo) 記 物CD20、CD79α、PAX5 等，但需要除外其他小B 細胞腫瘤，如套細胞淋巴瘤表達CD5 及CyclinD1，小淋巴細胞淋巴瘤表達CD23， 不表達Bcl-6、CD10 等生發(fā)中心的標(biāo)記物。 對于IHC 不能明確診斷的病例，進一步行B 細胞克隆性基因重排檢測。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測

免疫組織化學(xué)染色方法采用EnVisionTM二步法，EDTA 抗原修復(fù)液修復(fù)， 所用一抗為羊抗人FCRL4（1∶60，R&D systems 公司，美國）多克隆抗體，二抗為兔抗羊二抗（1∶100，Absin 公司，中國）。

以PBS 代替一抗作為陰性對照，以扁桃體組織作為陽性對照。

1.3 結(jié)果判定

根據(jù)FCRL4 表達的定位，以細胞膜和細胞漿上出現(xiàn)棕黃色顆粒判斷為陽性。 由2 名高年資病理醫(yī)生采用雙盲法讀片分析，免疫組織化學(xué)結(jié)果采用染色指數(shù)（staining index，SI）判定。 高倍鏡下隨機選取5 個病變視野，每個視野計數(shù)100 個細胞。陽性比率評分按陽性細胞數(shù)的百分比計算：0 分=0%～5%；1 分=6%～25%；2 分=26%～75%；3 分=76%～100%；染色強度分級：0 級=無；1 級=弱陽性；2 級=陽性；3 級=強陽性。 SI＝陽性比率評分×染色強度的值，0 分為陰性；1～3 分為低表達；4～9 分為高表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。 用χ2檢驗對FCRL4 在對照組、實驗組中的表達及FCRL4 的表達與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系進行統(tǒng)計分析。用Kaplan-Meier 分析FCRL4 蛋白表達與患者總體生存率之間的關(guān)系。P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征

共收集到72 例唾液腺MALT 淋巴瘤，其中男性19 例（19/72，26.39%），女性53 例（53/72，73.61%），男女之比為1∶2.8。 確診時患者的年齡為5～86 歲，平均年齡54 歲，中位年齡57 歲。 腫瘤最常見于腮腺，其次為腭部、下頜下腺，其他部位包括口底、唇、舌下腺、舌根、咽旁等。33.33%的患者確診時患有SS。所有患者中，Lugano 分期為IE 期的為61 例，IIE 期為9 例，IV 期為2 例。術(shù)后29 例患者行放化療。詳見表1。

表1 72 例唾液腺MALT 淋巴瘤的臨床病理資料Table 1 Clinicopathological characteristics of MALT lymphoid of salivary gland

對所有患者進行隨訪， 共收集到68 例患者的隨訪資料，隨訪率為94.44%。 隨訪時間為57～160 個月，平均隨訪時間為80 個月。其中，復(fù)發(fā)9 例（13.24%），8 例為MALT 淋巴瘤， 部位為唾液腺（6 例）、頸部（1 例）及肺部（1 例）；1 例復(fù)發(fā)后進展為DLBCL，位于胃部。 復(fù)發(fā)時間為9～72 個月，平均復(fù)發(fā)時間為27 個月。其中9 例患者死亡，3 例死于非腫瘤相關(guān)的疾病，6 例死亡原因不明。

2.2 唾液腺MALT 淋巴瘤、 唇腺BLEL、 大唾液腺BLEL 及頜面部DLBCL 中FCRL4 蛋白的表達情況

所有病例FCRL4 蛋白表達情況見表2，陽性部位主要定位于淋巴細胞的細胞膜及細胞漿。 唾液腺MALT 淋巴瘤中，68 例（68/72，94.44%）檢測到FCRL4蛋白表達，其中40 例（40/68，58.82%）低表達，28 例（28/68，41.18%）高表達。唾液腺MALT 淋巴瘤中，陽性細胞主要集中在上皮島周圍及上皮島內(nèi)的淋巴細胞，其他部位陽性細胞較少，且上皮島周圍及上皮島內(nèi)的淋巴細胞的表達強于其他部位的淋巴細胞（圖1）。

表2 唾液腺MALT 淋巴瘤、唇腺BLEL、大唾液腺BLEL 及頜面部DLBCL 中FCRL4 的蛋白表達（例）Table 2 The comparison of expression of FCRL4 in MALT lymphoma of salivary gland, BLEL of labial gland, BLEL of salivary gland and maxillofacial DLBCL(case)

對照組中，33%（3/10） 的唇腺BLEL 中存在FCRL4 表達，均為少量淋巴細胞低表達，且主要是導(dǎo)管周圍的細胞（圖2A、2B）；50%（10/20）的大唾液腺BLEL 中存在FCRL4 表達，其中，低表達9 例，高表達1 例，表達主要定位在上皮島內(nèi)、周邊及其導(dǎo)管上皮周邊的淋巴細胞，且陽性表達細胞較少（圖2C、2D）；在10%（3/30）的DLBCL 淋巴細胞中檢測到FCRL4 表達，均為低表達（圖1D）。

2.3 統(tǒng)計分析

χ2檢驗結(jié)果顯示， 唾液腺MALT 淋巴瘤中FCRL4 的表達顯著高于唇腺BLEL（P=0.013）、大唾液腺BLEL（P=0.003）及頜面部DLBCL（P=0.001），具體見表2。唾液腺MALT 淋巴瘤中FCRL4 蛋白的表達與患者年齡、性別、部位、是否合并SS 等臨床病理指標(biāo)之間均無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性（P＞0.05）。 Kaplan-Meier 法分析結(jié)果顯示，F(xiàn)CRL4 蛋白表達與患者總體生存率之間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 FCRL4 在唾液腺MALT 淋巴瘤及頜面部DLBCL 中的表達Figure 1 The expression of FCRL4 in salivary gland MALT lymphoma and maxillofacial DLBCL

圖2 FCRL4 在唇腺BLEL 及大唾液腺BLEL 中的表達情況Figure 2 The expression of FCRL4 in BLEL of labial grand and salivary gland

3 討論

本研究首次對唾液腺MALT 淋巴瘤臨床大樣本中FCRL4 蛋白表達情況進行了檢測，同時與唇腺BLEL、 大唾液腺BLEL 及頜面部DLBCL 中的表達進行了對比， 發(fā)現(xiàn)唾液腺MALT 淋巴瘤中FCRL4的表達明顯高于對照組， 提示FCRL4+B 淋巴細胞與腫瘤發(fā)生有一定關(guān)系， 且FCRL4 表達在唾液腺MALT 淋巴瘤的診斷中有一定參考價值。

FCRL4 蛋白特異性地表達在一種記憶B 細胞亞群的表面，該類細胞可以特征性地過表達某些細胞表面分子，如趨化因子受體1（C-C motif receptor 1，CCR1）、 趨化因子受體5 （C-C motif receptor 5，CCR5）、 轉(zhuǎn)錄因子SOX5、RUNX1 （runt-related transcription factor 1）等均參與免疫調(diào)控。正常人體組織中，F(xiàn)CRL4+的B 細胞主要位于扁桃體隱窩上皮內(nèi)及附近，具有一定的親上皮性，而在無上皮島的淋巴組織中非常罕見。 但是當(dāng)個體存在免疫系統(tǒng)被慢性激活的疾病如丙肝[9]或者類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[10]時，F(xiàn)CRL4+的B 細胞可以在外周血、滑膜液等中出現(xiàn)，提示該類細胞亞群與免疫性疾病有關(guān)。 BLEL 是一種與免疫系統(tǒng)關(guān)系密切的疾病，其基本病變構(gòu)成為增生淋巴組織和上皮島。 有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CRL4 特異性地在BLEL 上皮島周邊表達， 呈明顯的上皮趨向性， 提示FCRL4+的B 細胞與淋巴上皮結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)[6]。 進一步的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CRL4+的B 細胞具有趨上皮性的機制是由于增生上皮島的細胞可以產(chǎn)生趨化因子5 （chemokine 5，CCL5） 募集表面高表達CCL5 受體（CCR5）的FCRL4+B 細胞[11-13]。 我們的結(jié)果也證實在唾液腺MALT 淋巴瘤及淋巴上皮病變中，F(xiàn)CRL4+的B 細胞主要位于上皮島附近，與文獻報道的親上皮性相一致。

唾液腺MALT 淋巴瘤常在BLEL 的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，在疾病早期，腫瘤性淋巴細胞總是位于上皮島內(nèi)或緊鄰上皮島的周邊， 提示發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞與上皮關(guān)系密切。 我們的研究結(jié)果表明，唾液腺MALT 淋巴瘤中，94.44%的病例中存在FCRL4+的B 淋巴細胞，且均與上皮關(guān)系密切，在緊鄰上皮的部位表達強度明顯高于遠離上皮的部位。另外，F(xiàn)CRL4 在唾液腺MALT 淋巴瘤中的表達明顯高于唇腺BLEL 和大唾液腺BLEL， 這一結(jié)果與Haacke 等[6]的研究結(jié)果相一致。 在唇腺BLEL 中，F(xiàn)CRL4+B 淋巴細胞較少，散在于導(dǎo)管上皮細胞的周邊， 而在大唾液腺BLEL 中，F(xiàn)CRL4+B 淋巴細胞有增多趨勢， 這可能與唇腺BLEL 中常無增生上皮島而大唾液腺BLEL 中增生上皮島較明顯有關(guān)。 當(dāng)病變進一步發(fā)展為MALT 淋巴瘤后，F(xiàn)CRL4+B 淋巴細胞數(shù)目進一步增加， 提示FCRL4+B 淋巴細胞亞群可能參與了BLEL 中淋巴細胞的惡性轉(zhuǎn)化。

本研究中， 我們同時檢測了頜面部最常見的B細胞淋巴瘤DLBCL 中FCRL4 的表達，發(fā)現(xiàn)在10%的DLBCL 中存 在FCRL4 表 達。 Ikeda 等[14]報 道 在DLBCL 中，F(xiàn)CRL4 表達率可達33.7%， 且在非生發(fā)中心來源的DLBCL 中的表達明顯高于生發(fā)中心來源的腫瘤，而MALT 淋巴瘤為來源于邊緣區(qū)淋巴組織的B 細胞淋巴瘤， 與非生發(fā)中心來源的DLBCL是否在起源上有某種程度上的交叉還不得而知，其具體機制還有待于進一步研究。

我們首次統(tǒng)計了唾液腺MALT 淋巴瘤中FCRL4 蛋白表達與臨床病理指標(biāo)及預(yù)后之間的關(guān)系，結(jié)果顯示FCRL4 的表達與臨床病理指標(biāo)、預(yù)后等之間無明顯相關(guān)性， 提示FCRL4+B 淋巴細胞可能與唾液腺MALT 淋巴瘤的發(fā)生相關(guān)，但在病變進展中的作用還有待于進一步研究。 由于本研究只用免疫組織化學(xué)方法檢測了FCRL4 的蛋白表達情況，利用更精準的技術(shù)如熒光定量PCR、轉(zhuǎn)錄組測序檢測FCRL4 在不同組織中的表達將是我們進一步研究的方向。

綜上所述， 我們的結(jié)果表明， 在唾液腺MALT淋巴瘤中，F(xiàn)CRL4 蛋白表達程度高于其前驅(qū)病變BLEL，且表達FCRL4 的腫瘤細胞與上皮島相鄰，提示FCRL4+ B 淋巴細胞可能參與了BLEL 的惡性轉(zhuǎn)化，并且上皮細胞的趨化作用在其惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)生了作用。 而唾液腺MALT 淋巴瘤中FCRL4 表達明顯高于頜面DLBCL，提示其在腫瘤的鑒別診斷中有一定價值。