巨噬細(xì)胞極化與骨組織再生關(guān)系的研究進(jìn)展

梁蓓蕾， 王佐林

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科，上海 200072）

腫瘤切除、牙周炎等引起的骨缺損，通常需要使用骨生物材料進(jìn)行手術(shù)治療[1]。 作為異物，植入物被免疫系統(tǒng)識(shí)別并引發(fā)顯著的免疫反應(yīng)，繼而影響成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為。 在這一背景下，骨生物材料的設(shè)計(jì)范例已從相對(duì)惰性轉(zhuǎn)變?yōu)橹鲃?dòng)免疫調(diào)節(jié)[2]。 巨噬細(xì)胞作為第1 批到達(dá)的免疫細(xì)胞，其隨局部環(huán)境產(chǎn)生不同功能表型的能力，使骨生物材料的免疫調(diào)節(jié)功能成為可能，因而在骨組織再生領(lǐng)域備受關(guān)注[3]。

1 巨噬細(xì)胞及其極化

巨噬細(xì)胞（macrophage）因其吞噬效應(yīng)消除有害病原體的保護(hù)作用而聞名[4]。 過(guò)去公認(rèn)的巨噬細(xì)胞主要來(lái)源于髓系單核細(xì)胞，通過(guò)響應(yīng)受損組織或與病原體相關(guān)信號(hào)經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入組織發(fā)揮免疫作用。 但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，早在胚胎發(fā)育過(guò)程中即已產(chǎn)生一些組織駐留的巨噬細(xì)胞， 在損傷期間，通過(guò)快速增殖維持其局部群體， 共同參與組織修復(fù)、免疫監(jiān)視和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持[5]。

巨噬細(xì)胞極化是巨噬細(xì)胞響應(yīng)局部微環(huán)境中的信號(hào)， 分化為具有不同功能表型頻譜細(xì)胞的過(guò)程[6]。 早在20 世紀(jì)90 年代初期，干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞已被定義為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞，它們通過(guò)分泌大量炎性細(xì)胞因子[如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）]及趨化因子（如CC 趨化因子配體2）參與炎癥反應(yīng)及殺菌過(guò)程[7]。 而隨后的研究發(fā)現(xiàn)，IL-4 誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞的吞噬和殺傷效應(yīng)明顯下降，轉(zhuǎn)而通過(guò)分泌抗炎因子（如IL-10），生長(zhǎng)因子[如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factorβ， TGF-β）， 血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）]等發(fā)揮抗炎作用，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)沉積、 血管生成等參與組織修復(fù)過(guò)程。為表示區(qū)分，此類巨噬細(xì)胞被定義為“替代活化型巨噬細(xì)胞”[8]。

隨后鏡像“Th1/Th2”細(xì)胞命名法，“M1/M2”二分法被提出以分別對(duì)應(yīng)此前提出的經(jīng)典/替代活化型巨噬細(xì)胞的定義，M0 則被用以標(biāo)記未活化巨噬細(xì)胞亞型。 第3 代的定義將M2 型巨噬細(xì)胞進(jìn)一步區(qū)分為M2a、M2b 和M2c 3 種亞群[9]。 M2a 表型響應(yīng)IL-4 和IL-13，以增加表面標(biāo)志物CD206、精氨酸酶和TGF-β 的表達(dá)為特征；M2b 表型暴露于IgG 免疫復(fù)合物和IL-1β， 增加IL-10 的產(chǎn)生并降低IL-12；M2c 表型則在IL-10、TGF-β 或糖皮質(zhì)激素刺激作用下產(chǎn)生， 其特征是高表達(dá)IL-10 和表面受體CD163。但是，巨噬細(xì)胞的極化類型可隨時(shí)通過(guò)局部微環(huán)境的變化發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。 巨噬細(xì)胞極化應(yīng)該被視為一個(gè)具有系列表型的平衡譜，而不是簡(jiǎn)單理解為劃分為群的狀態(tài)[7]。 由于表達(dá)標(biāo)記的重疊，目前最常使用的依然是“M1/M2 型”或“M1/M2 樣”分類方法[4]。

2 骨組織再生的過(guò)程

當(dāng)骨組織受到損傷時(shí)，血管破裂，血小板被激活，多種凝血因子、細(xì)胞因子及趨化因子釋放，引發(fā)止血效應(yīng)， 多種類型細(xì)胞受募集遷移至損傷部位，促成骨組織修復(fù)的初始階段[9]。 生物材料作為異物，一旦被植入，材料表面將吸附血漿蛋白以形成蛋白吸附層，從而啟動(dòng)血小板和其他血液凝固因子誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)，骨再生開(kāi)始[10]。

中性粒細(xì)胞首先到達(dá)損傷部位， 并提供信號(hào)分子，募集巨噬細(xì)胞到達(dá)損傷部位[11]。其后，巨噬細(xì)胞開(kāi)始占據(jù)主導(dǎo)地位[9]，通過(guò)分泌細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)一步募集白細(xì)胞。 此外，巨噬細(xì)胞能夠去除凋亡的中性粒細(xì)胞， 其吞噬作用可能導(dǎo)致更多M1 型巨噬細(xì)胞向M2 型巨噬細(xì)胞改變和炎癥期的消退[3]。其他免疫細(xì)胞， 也通過(guò)局部分泌參與傷口愈合的早期階段，并影響單核/巨噬細(xì)胞的極化與破骨分化[11]。

隨后的增殖期涉及細(xì)胞增殖、血管生成、膠原沉積[12]。 該期間巨噬細(xì)胞的參與和極化可能對(duì)隨后的重塑階段產(chǎn)生顯著影響。 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs） 增殖及膠原蛋白沉積所需的一些支持性生長(zhǎng)因子，包括TGF-β 及骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMPs）等均可由巨噬細(xì)胞分泌[1]。

在沉積大量膠原后，重塑階段開(kāi)始。 軟的愈傷組織礦化并轉(zhuǎn)化為具有不規(guī)則排列的（編織）骨的骨愈傷組織，并伴有新生血管侵入[9]。 隨后編織骨重塑為正常的層狀骨，這依賴于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的平衡[13]。 巨噬細(xì)胞作為破骨細(xì)胞同源細(xì)胞或前體細(xì)胞[14]，似乎能夠參與協(xié)調(diào)骨代謝平衡。

3 巨噬細(xì)胞及其極化與骨組織修復(fù)的關(guān)系

如上所述，巨噬細(xì)胞是骨組織再生過(guò)程中的關(guān)鍵介質(zhì)。 首先，巨噬細(xì)胞能夠通過(guò)吞噬作用清除侵入的生物體、受損的細(xì)胞碎片及凋亡的中性粒細(xì)胞等；其次，巨噬細(xì)胞響應(yīng)組織微環(huán)境的變化而大量增殖并經(jīng)歷顯著的表型及功能改變，成為各類細(xì)胞外基質(zhì)成分和促組織修復(fù)再生的可溶性介質(zhì)的有效來(lái)源[2]；再次，巨噬細(xì)胞還可通過(guò)調(diào)節(jié)參與骨愈合過(guò)程的細(xì)胞（如MSCs）在組織再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]，并能激活環(huán)境中的其他細(xì)胞以表達(dá)更多對(duì)骨構(gòu)建有益但不主要由其產(chǎn)生的細(xì)胞因子，各種細(xì)胞類型之間串?dāng)_為骨再生的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)提供了基礎(chǔ)[14]。

多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了巨噬細(xì)胞的重要性。 骨損傷修復(fù)過(guò)程中的巨噬細(xì)胞耗竭導(dǎo)致骨愈合受損，巨噬細(xì)胞缺陷動(dòng)物的愈傷組織較小，骨含量較少[3]。此外，巨噬細(xì)胞的重要性還具有一定的時(shí)間效應(yīng)。 軟骨內(nèi)骨折愈合的小鼠若在炎癥早期耗竭巨噬細(xì)胞，軟骨性軟愈傷組織的形成被完全消除，而在后期耗竭巨噬細(xì)胞則導(dǎo)致愈傷組織變小，愈傷組織的大小與愈傷組織中剩余巨噬細(xì)胞的數(shù)量成正比[15]。需要關(guān)注的是，巨噬細(xì)胞被“激活”可獲得一系列表型，各極化亞型在骨組織再生過(guò)程中的作用也成為了研究的熱點(diǎn)課題。

3.1 M0 巨噬細(xì)胞對(duì)骨組織再生的影響

Chang 等[16]關(guān)注了原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)物的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)從小鼠顱骨分離的原始成骨細(xì)胞培養(yǎng)物中含有11%～17%的F4/80 +巨噬細(xì)胞。 從原代培養(yǎng)物中耗盡巨噬細(xì)胞時(shí)，礦化和成骨細(xì)胞分化基因的表達(dá)顯著降低。Nicolaidou 等[17]發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞產(chǎn)生的抑瘤素M（oncostatin-M，OSM）能增強(qiáng)人MSCs 成骨分化。 然而也有學(xué)者認(rèn)為分泌在巨噬細(xì)胞上清液中的IL-1β、TNF-α 等細(xì)胞因子對(duì)成骨分化起抑制作用[18]。

3.2 M1 巨噬細(xì)胞對(duì)骨組織再生的影響

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，經(jīng)典活化的炎性巨噬細(xì)胞（M1）分泌大量炎性細(xì)胞因子， 上調(diào)核因子κB 受體活化因 子 配 體 （receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL），增強(qiáng)破骨細(xì)胞的分化和吸收，導(dǎo)致骨量表達(dá)降低[19]。然而，高碩等[20]發(fā)現(xiàn)LPS 存在的炎性條件下， 巨噬細(xì)胞能增強(qiáng)MSCs 的遷移能力。 此外， 在Transwell 系統(tǒng)中，LPS 活化的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞，顯示出更明顯的鈣化[14]。

3.3 M2 巨噬細(xì)胞對(duì)骨組織再生的影響

Gong 等[21]發(fā)現(xiàn)與M2 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的MSCs中ALP 活性及骨礦化增加， 成骨相關(guān)基因上調(diào)，這些結(jié)果可能是由M2 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促再生細(xì)胞因子（如TGF-β、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等）介導(dǎo)的。 Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)，各型巨噬細(xì)胞均以不同方式影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，M0 和M1 巨噬細(xì)胞部分增強(qiáng)了早期和中期的成骨效應(yīng)，但未促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化；而與M2 巨噬細(xì)胞直接或間接共培養(yǎng)的MSCs獲得更明顯的基質(zhì)礦化。

綜上所述， 在不同實(shí)驗(yàn)室的特定共培養(yǎng)條件下，所有巨噬細(xì)胞亞型對(duì)骨再生的作用似乎是一個(gè)有趣而矛盾的結(jié)果。 但Spiller 等[23]的研究可能帶來(lái)新的思路，該研究認(rèn)為在血管網(wǎng)發(fā)芽、吻合和成熟過(guò)程中，M1 巨噬細(xì)胞分泌引發(fā)血管生成過(guò)程的因子（如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）；M2a 巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管融合， 并可能通過(guò)PDGF-BB 的分泌募集周細(xì)胞；M2c 巨噬細(xì)胞則促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞體外發(fā)芽，并分泌高水平的MMP9 在血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。 這項(xiàng)研究的結(jié)果顯示了巨噬細(xì)胞控制血管生成的復(fù)雜性。同樣， 骨組織再生過(guò)程也是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)體反應(yīng)，在此過(guò)程中，各型巨噬細(xì)胞可能也需要不同階段協(xié)同作用才能得到最終的重塑骨組織。

4 通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)骨組織再生

基于巨噬細(xì)胞的功能可塑性及其與骨組織再生的串?dāng)_，通過(guò)靶向巨噬細(xì)胞來(lái)促進(jìn)骨組織再生的生物材料備受關(guān)注，其策略主要分為2 種。 一種是調(diào)節(jié)骨缺損部位巨噬細(xì)胞的數(shù)量。 Raggatt 等[15]提出，通過(guò)增加骨折部位巨噬細(xì)胞數(shù)量的方法可以增強(qiáng)骨再生。 這些研究表明，損傷時(shí)局部注射巨噬細(xì)胞集落刺激因子（monocyte colony-stimulating factor，M-CSF）可顯著增加骨折部位巨噬細(xì)胞的數(shù)量，從而改善膜內(nèi)骨和軟骨內(nèi)骨的形成。 另一種是通過(guò)改變骨修復(fù)材料的理化性質(zhì)和生物材料釋放的離子和可溶性因子等， 調(diào)節(jié)局部巨噬細(xì)胞極化以支持骨再生。天然的光滑鈦會(huì)引起急性炎癥和M1 極化，而經(jīng)硅烷化處理的鈦的炎癥性則明顯降低，并能通過(guò)適度參與NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 極化[24]。 含鍶生物活性玻璃微球（strontium-contained bioactive glasses microspheres， SrBGM）可通過(guò)將M1轉(zhuǎn)化為M2 來(lái)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型， 并表達(dá)高水平的PDGF-BB，有助于早期血管生成，并促進(jìn)體內(nèi)新骨形成[25]。 Chen 等[26]制備了二氧化鈦納米管上的雙水凝膠層系統(tǒng)作為儲(chǔ)庫(kù)， 通過(guò)IFN-γ 和IL-4 的順序作用來(lái)調(diào)節(jié)從M1 到M2 的巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，分子的順序釋放受自然愈合過(guò)程的啟發(fā)， 滿足順序釋放策略要求的材料的開(kāi)發(fā)有望顯著提高組織工程中免疫調(diào)節(jié)的技術(shù)水平。

綜上所述，巨噬細(xì)胞及其響應(yīng)局部微環(huán)境所獲得獨(dú)特的功能表型在骨組織再生過(guò)程中具有重要意義，通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞改變骨再生相關(guān)細(xì)胞命運(yùn)和行為的有效性已得到很好的證實(shí)。 但對(duì)于特定線索對(duì)巨噬細(xì)胞行為及其后續(xù)功能影響的細(xì)節(jié)的理解尚不完整， 一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)尚不確定或相互矛盾，這就使基于此設(shè)計(jì)的組織工程材料的臨床轉(zhuǎn)化受到限制。 因此，充分了解巨噬細(xì)胞及其極化在骨組織再生過(guò)程中的細(xì)節(jié)（如各極化類型出現(xiàn)的時(shí)期、比例狀態(tài)、功能作用等），并在此基礎(chǔ)上更加有效地選擇巨噬細(xì)胞極化的時(shí)間點(diǎn)及方式，將會(huì)成為未來(lái)實(shí)現(xiàn)更好的組織工程材料開(kāi)發(fā)及臨床轉(zhuǎn)化的重要研究方向。