MiR-579-3p 靶向肌動蛋白相關(guān)蛋白3B 調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究

高功杰， 王海業(yè)， 李曉彥

（1. 鄭州植得口腔醫(yī)院，河南 鄭州 450052；2. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科，河南 鄭州 450033；3. 鄭州人民醫(yī)院鄭東院區(qū)普外科，河南 鄭州 450003）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）簡稱口腔鱗癌，是口腔頜面部常見的腫瘤之一，其發(fā)病率呈增長趨勢。OSCC 的治療主要以手術(shù)為主，并輔助放療、化療等[1]。 隨著醫(yī)學(xué)水平的進(jìn)步，OSCC 的治療效果有了很大改善，但中晚期患者5 年生存率依然較低，預(yù)后不佳[2]。 因此，進(jìn)一步探究OSCC 發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，提供新的治療靶點或途徑，對于提高OSCC 療效和改善患者預(yù)后具有重要意義。 微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子非編碼單鏈RNA， 在真核生物中廣泛存在。miRNA 可通過與靶基因的3′非翻譯區(qū) （3′untranslated region，3′UTR） 靶向結(jié)合調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長、分化、凋亡等生物學(xué)行為，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-5]。 microRNA-579-3p（miR-579-3p）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類RNA，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。 研究顯示，miR-579-3p 低表達(dá)與黑色素瘤患者預(yù)后不良及耐藥性密切相關(guān)， 過表達(dá)miR-579-3p 可降低人黑色素瘤細(xì)胞耐藥性，提高治療效果[6]。miR-579-3p 過表達(dá)通過靶向抑制巨噬細(xì)胞清道夫受體1（recombinant macrophage scavenger receptor 1，MSR1）蛋白表達(dá)顯著降低了OSCC 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[7]。 但目前，miR-579-3p 對OSCC 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響還未知。生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，ACTR3B可能是miR-579-3p 的靶基因。ACTR3B可編碼肌動蛋白相關(guān)蛋白， 在肌動蛋白細(xì)胞骨架中發(fā)揮重要作用。Yu 等[8]研究表明，ACTR3B 表達(dá)升高可促進(jìn)結(jié)腸和直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。 目前，miR-579-3p 和ACTR3B 在OSCC 中的作用還未知。 本研究主要探討了miR-579-3p 對OSCC 細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可否通過調(diào)控ACTR3B 影響OSCC 細(xì)胞的增殖和凋亡，以期為OSCC 的靶向分子治療提供新途徑。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和實驗試劑

正常人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞（NHOK）和OSCC 細(xì)胞系CAL27、CAL33、SCC15 （中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（浙江天杭生物科技股份有限公司，中國）；胰蛋白酶和RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國）；ACTR3B 過表達(dá)載體（pcDNA-ACTR3B）和LipofectamineTM2000 試劑盒（Invitrogen 公司，美國）；miR-579-3p 模擬物（mimcs）及陰性對照、miR-579-3p 抑制劑及陰性對照、ACTR3B 的小干擾RNA（廣州伯信生物科技有限公司，中國）；TRIzol 試劑， 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR 試劑盒（Takara 公司，日本）；引物序列（上海生工生物工程有 限 公 司， 中 國）；ACTR3B 抗 體 （Cell Signaling Technology 公司， 美國）； 兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和活化的半胱天冬酶-3（C-caspase-3）多克隆抗體（Santa Cruz 公司，美國）；四甲基噻唑藍(lán)（Sigma 公司，美國）；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide， PI）細(xì)胞凋亡試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，中國）；雙熒光素酶活性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NHOK 和OSCC 細(xì)胞系CAL27、CAL33、SCC15 均用含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2、97%濕度）中培養(yǎng)。 每隔2 d 更換1 次新鮮培養(yǎng)基。 待細(xì)胞匯合至80%～90%時，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 對數(shù)增殖期的CAL33 細(xì)胞以每孔1×105個的密度接種于6 孔板中， 待細(xì)胞匯合至60%時， 更換無FBS 培養(yǎng)基。 參照LipofectamineTM2000 試劑盒操作說明書， 將miR-579-3p mimcs（miR-579-3p 組）及 陰 性 對 照（miR-NC 組）、miR-579-3p 抑 制 劑（anti-miR-579-3p 組）及 陰 性 對照 （anti-miR-NC 組）、ACTR3B 的小干擾RNA（si-ACTR3B 組） 及陰性對照 （si-NC 組）、miR-579-3p mimcs 與ACTR3B 過表達(dá)載體 （miR-579-3p+pcDNA-ACTR3B 組）、miR-579-3p mimcs 與空載體（miR-579-3p+pcDNA-NC 組）分別轉(zhuǎn)染至CAL33 細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染12 h 后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。 qRT-PCR 檢測細(xì)胞中miR-579-3p 表達(dá)，western blot 檢測細(xì)胞中ACTR3B 蛋白水平，驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3 qRT-PCR檢 測miR-579-3p和ACTR3B mRNA表達(dá) 磷酸緩沖鹽溶液 （phosphate buffer saline，PBS）清洗細(xì)胞，加入TRIzol 試劑提取細(xì)胞中總RNA。微量核酸儀檢測RNA 的純度和濃度，RNA溶液在260 nm 與280 nm 波長處吸光度（absorbance，A）的比值在1.8～2.0，說明純度較好。 然后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書， 將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。 以cDNA 為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變 性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 共進(jìn)行45 個循環(huán)。 引物序列：miR-579-3p 正 向5'-TTGCAGACTCGCGGCAG-3'， 反 向5'-CGCCGCGTAGAAACGTT-3'；ACTR3B 正 向 5'-AGAAAATGGCGCAAAATC-3'， 反 向5'-AAAATAGGCTGGGAGGAAA-3'；U6 正 向5'-GCAAGGATGTGGTCGTG-3'， 反 向5'-ACTGAGCCCCGAATGAA-3'；β-actin 正向5'-AGCCACCCCACTTCTCTCT-3'，反向5'-CCTCCCCTGTGTGGACTT-3'。 miR-579-3p 以U6為 內(nèi) 參，ACTR3B 以β-actin 為 內(nèi) 參，2-△△Ct法 計 算miR-579-3p 和ACTR3B mRNA 的相對表達(dá)水平。

1.2.4 Western blot檢 測 細(xì) 胞 中ACTR3B、Cyclin D1和C-caspase-3蛋白水平 加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液， 提取細(xì)胞中總蛋白，BCA 蛋白濃度法測定蛋白濃度。 取適量蛋白，在100 ℃下煮沸5 min。變性后，每孔30 μg 蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。 電泳后，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，于5%脫脂牛奶中封閉1 h。分別加入ACTR3B 、Cyclin D1和C-caspase-3 抗體，4 ℃下孵育過夜。 次日，TBST緩沖液洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG，37 ℃下孵育1 h。TBST 緩沖液洗膜后，加入ELC 顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.5 MTT法檢測CAL33細(xì)胞增殖 各組轉(zhuǎn)染后的CAL33 細(xì)胞以5×103個的密度接種于96 孔板中。每組設(shè)置3 個復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h。 吸棄培養(yǎng)基，加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩混勻后，于酶標(biāo)儀490 nm 處測定吸光度（A）值。 實驗重復(fù)3 次。 細(xì)胞存活率（%）=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測CAL33細(xì)胞凋亡 各組轉(zhuǎn)染后的CAL33 細(xì)胞以每孔2.5×104個的密度接種于24 孔板中。 每組設(shè)置3 個復(fù)孔。 培養(yǎng)48 h 后，胰酶消化，收集細(xì)胞于流式管中。 PBS 清洗細(xì)胞3 次，4 ℃、1 000 r/min 離心5 min， 吸棄上清液。 參照Annexin V-FITC/PI 試劑盒操作說明書， 加入200 μL結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞。 加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。 最后再加入300 μL 結(jié)合緩沖液， 混合均勻后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-579-3p和ACTR3B靶向關(guān)系 Starbase 生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，ACTR3B 的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）存在與miR-579-3p 結(jié)合的核苷酸序列。 PCR 擴(kuò)增含miR-579-3p 結(jié)合位點的ACTR3B 的3′UTR 序列，并插入pGL3 質(zhì)粒載體的相應(yīng)位點構(gòu)建ACTR3B 野生型質(zhì)粒（WT-ACTR3B）。通過基因定點突變技術(shù)將結(jié)合位點突變后， 插入pGL3 質(zhì)粒載體的相應(yīng)位點構(gòu)建ACTR3B 突變型質(zhì)粒（MUT-ACTR3B）。 然后分別將WT-ACTR3B、MUT-ACTR3B 與 miR-579-3p mimic及陰性對照共轉(zhuǎn)染至CAL33 細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染12 h 后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞。 參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明書， 檢測熒光素酶活性，結(jié)果以熒光素活性/海腎熒光強(qiáng)度比值表示各組的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 22.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)。 計量資料以（±s）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSCC 細(xì)胞系中miR-579-3p 和ACTR3B 表達(dá)水平

與NHOK 比較， 口腔鱗癌細(xì)胞系CAL27、CAL33 和SCC15 中miR-579-3p 表達(dá)水平降低 （P＜0.05），ACTR3B mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高 （P＜0.05）。 選擇CAL33 細(xì)胞為研究對象， 進(jìn)行后續(xù)研究。 詳見圖1 和表1。

圖1 Western blot 檢測ACTR3B 蛋白表達(dá)Figure 1 Western blot detected the expression of ACTR3B protein

2.2 過表達(dá)miR-579-3p 對口腔鱗癌CAL33 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

miR-579-3p 組CAL33 細(xì)胞中miR-579-3p 水平高于miR-NC 組（P＜0.05），表明miR-579-3p mimics轉(zhuǎn)染成功，CAL33 細(xì)胞中miR-579-3p 過表達(dá)。 與miR-NC 組比較，miR-579-3p 組CAL33 細(xì)胞存活率和CyclinD1 蛋白水平降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率和C-caspase-3 蛋白水平升高（P＜0.05）。 詳見圖2 和表2。

表1 OSCC 細(xì)胞系中miR-579-3p 和ACTR3B 表達(dá)水平（x±s ，n=9）Table 1 Expression levels of miR-579-3p and ACTR3B in oral squamous carcinoma cell lines (x±s, n=9)

2.3 沉默ACTR3B 對口腔鱗癌CAL33 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

si-ACTR3B 組CAL33 細(xì)胞中ACTR3B 蛋白水平高于si-NC 組 （P＜0.05）， 表明ACTR3B 小干擾RNA 轉(zhuǎn)染成功，CAL33 細(xì)胞中ACTR3B 表達(dá)沉默。與si-NC 組比較，si-ACTR3B 組CAL33 細(xì)胞存活率和CyclinD1 蛋白水平降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率和C-caspase-3 蛋白水平升高（P＜0.05）。詳見表3 和圖3。

2.4 miR-579-3p 靶向調(diào)控ACTR3B 表達(dá)

圖2 過表達(dá)miR-579-3p 對CAL33 細(xì)胞增殖和凋亡的影響Figure 2 Effect of overexpression of miR-579-3p on the proliferation and apoptosis of CAL33 cells

表2 過表達(dá)miR-579-3p 對CAL33 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（x±s ，n=9）Table 2 Effects of overexpression of miR-579-3p on the proliferation and apoptosis of CAL33 cells (x±s, n=9)

表3 沉默ACTR3B 對CAL33 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（x±s ，n=9）Table 3 Effect of silencing ACTR3B on the proliferation and apoptosis of CAL33 cells (x±s, n=9)

圖3 Western blot 檢 測ACTR3B、CyclinD1、C-caspase-3 蛋 白 的表達(dá)Figure 3 Western blot detected the expression of ACTR3B, CyclinD1, C-caspase-3 protein

Starbase 軟 件 預(yù) 測 顯 示，ACTR3B的3′UTR中含有與miR-579-3p 互補(bǔ)的核苷酸序列， 提示ACTR3B是miR-579-3p 的靶基因（圖4）。 雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，與miR-NC 組比較，miR-579-3p 組共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ACTR3B 的熒光素酶活性降低（P＜0.05）， 共轉(zhuǎn)染MUT-ACTR3B 的熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05），說明miR-579-3p 可與ACTR3B 的3′UTR 靶向結(jié)合（表4）。 miR-579-3p 組ACTR3B 蛋白水平低于miR-NC 組 （P＜0.05），anti-miR-579-3p組ACTR3B 蛋白水平低于anti-miR-NC 組（P＜0.05），進(jìn)一步說明miR-579-3p 靶向負(fù)調(diào)控ACTR3B 表達(dá)（表5）。

2.5 過表達(dá)ACTR3B 降低了過表達(dá)miR-579-3p 對OSCC CAL33 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與miR-579-3p+pcDNA-NC 組比較，miR-579-3p+pcDNA-ACTR3B 組CAL33 細(xì)胞存活率和CyclinD1 蛋白水平升高 （P＜0.05）， 細(xì)胞凋亡率和Ccaspase-3 蛋白水平降低（P＜0.05）。詳見表6 和圖5。

圖4 miR-579-3p 靶向調(diào)控ACTR3B 表達(dá)Figure 4 miR-579-3p targets ACTR3B expression

表4 雙熒光素酶活性檢測結(jié)果（x±s ，n=9）Table 4 Test results of double luciferase activity (x±s, n=9)

表5 miR-579-3p 對ACTR3B 蛋白表達(dá)的影響（x±s ，n=9）Table 5 Effect of miR-579-3p on the expression of ACTR3B protein (x±s, n=9)

表6 過表達(dá)ACTR3B 降低了miR-579-3p 過表達(dá)對CAL33 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（x±s ，n=9）Table 6 Overexpression of ACTR3B reduced the effect of miR-579-3p overexpression on the proliferation and apoptosis of CAL33 cells(x±s, n=9)

圖5 Western blot 檢測ACTR3B、CyclinD1、C-caspase-3 蛋白表達(dá)Figure 5 Western blot detected the expression of ACTR3B, CyclinD1, C-caspase-3 protein

3 討論

OSCC 是常見的頭頸部惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤的3%[9]。 由于OSCC 具有較強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的特點，其治療效果不佳，給人類的健康帶來嚴(yán)重的威脅[10]。因此，闡明OSCC 發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找影響OSCC 發(fā)生、發(fā)展的分子靶點是靶向治療OSCC 急需解決的關(guān)鍵問題。

近年來的研究顯示，miRNA 在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miRNA 通過識別靶基因并與之結(jié)合，降解靶分子mRNA 或阻止靶基因蛋白質(zhì)的合成，從而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮“促癌”或“抑癌”作用[11]。如He 等[12]的研究顯示，過表達(dá)miR-133a-3p 可通過直接靶向調(diào)控Ⅰ型膠原α 鏈抑制OSCC 細(xì)胞的增殖和遷移。 Rastogi 等[13]的研究顯示，過表達(dá)miR-377通過靶向組蛋白去乙酰化酶9 抑制了OSCC 細(xì)胞的生長和遷移， 并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，miR-377 可能是OSCC 治療的新靶點。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展往往涉及多個編碼基因的改變。 研究還顯示，1 個miRNA 可調(diào)控多個基因的表達(dá)， 這使得miRNA 作為抗癌靶點時，將比單個編碼RNA 蛋白基因靶點更為廣泛，且穩(wěn)定有效[3，14-15]。

miR-579-3p 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，它參與黑色素瘤[16]、帕金森病[17]等疾病的發(fā)生和發(fā)展，但目前在OSCC 中的作用還未知。 本研究首先以NHOK 為對照，qRT-PCR 檢測了OSCC 細(xì)胞系CAL27、CAL33、SCC15 中miR-579-3p 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，CAL27、CAL33、SCC15 細(xì)胞系中miR-579-3p 表達(dá)水平明顯低于NHOK， 提示miR-579-3p 可能參與了OSCC 的發(fā)生、 發(fā)展過程。 接著以O(shè)SCC 細(xì)胞系CAL33 為研究對象， 轉(zhuǎn)染miR-579-3p mimics 后，CAL33 細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，提示過表達(dá)miR-579-3p 可抑制OSCC 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是OSCC 治療的潛在靶點。CyclinD1 是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞由G1 期向S 期轉(zhuǎn)變，縮短細(xì)胞周期[18]。 半胱天冬酶（caspase）級聯(lián)反應(yīng)在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，caspase-3 是caspase 級聯(lián)反應(yīng)的重要調(diào)控蛋白，其活化后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。 本研究顯示， 過表達(dá)miR-579-3p 可降低CAL33 細(xì)胞中CyclinD1 蛋白水平，提高C-caspase-3蛋白水平， 提示miR-579-3p 可能通過影響細(xì)胞中CyclinD1 和C-caspase-3 蛋白水平抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

為了進(jìn)一步探討miR-579-3p 影響OSCC 細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制，本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測，ACTR3B可能是miR-579-3p 的靶基因。ACTR3B參與肌動蛋白細(xì)胞骨架形成，其在心臟、大腦、 白細(xì)胞中呈高表達(dá)。 本研究顯示，ACTR3B的mRNA 和蛋白在OSCC 細(xì)胞系中表達(dá)升高， 沉默ACTR3B可降低CAL33 細(xì)胞存活率及CyclinD1 蛋白水平， 并提高細(xì)胞凋亡率及C-caspase-3 蛋白水平， 提示ACTR3B作為促癌基因參與OSCC 發(fā)生、發(fā)展，抑制其表達(dá)是OSCC 治療的新途徑。本研究雙熒光素酶實驗顯示，miR-579-3p 可與ACTR3B的3′UTR 靶向結(jié)合， 且過表達(dá)細(xì)胞中miR-579-3p 后，ACTR3B 蛋白水平降低， 而抑制miR-579-3p 表達(dá)，ACTR3B 蛋白水平升高，證實了miR-579-3p 在OSCC 細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控ACTR3B表達(dá)。 本研究還顯示， 過表達(dá)ACTR3B逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-579-3p 對CAL33 細(xì)胞增殖、 凋亡的影響， 提示過表達(dá)miR-579-3p 通過靶向抑制ACTR3B表達(dá)發(fā)揮抗OSCC的作用。

綜上所述，miR-579-3p 在OSCC 細(xì)胞系中呈低表達(dá)， 過表達(dá)miR-579-3p 可抑制OSCC 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其可能通過靶向抑制ACTR3B發(fā)揮作用。 但本研究僅在細(xì)胞層面進(jìn)行了初步探討，接下來將通過動物實驗深入探討miR-579-3p 在體內(nèi)對腫瘤生長的影響及其他可能的作用機(jī)制，以期為OSCC 的靶向分子治療提供新途徑。