炎癥微環(huán)境對(duì)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及Sirt6 表達(dá)水平的影響

王 開(kāi)， 荊得寶， 于素平， 劉雪陽(yáng)

（第二軍醫(yī)大學(xué)附屬公利醫(yī)院口腔科，上海 200135）

炎癥性吸收是導(dǎo)致頜骨缺損的主要因素之一。頜骨缺損、 牙齒缺失往往伴有衰老趨勢(shì)的出現(xiàn)，這不僅影響咀嚼功能和身心健康，甚至?xí)T發(fā)其他的系統(tǒng)性疾病。 如何重塑頜骨形態(tài)、抑制炎癥性吸收，具有重要意義。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，可以通過(guò)體外誘導(dǎo)定向分化為成骨細(xì)胞，成為骨形成的基礎(chǔ)，為研究頜骨重塑提供了可靠的來(lái)源。

Sirt6 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的組蛋白，是沉默配型信息調(diào)節(jié)蛋白家族（Sirtuin）的重要成員。 研究表明，Sirt6 不僅具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用， 而且對(duì)多種細(xì)胞具有抗衰老的作用[1-4]。研究證明，Sirt6 是破骨細(xì)胞的抑制因子， 但是具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。 本研究基于牙周病的高發(fā)病率和頜骨破壞導(dǎo)致炎性衰老， 甚至?xí)T發(fā)其他系統(tǒng)性疾病為背景， 探討炎癥狀態(tài)下，Sirt6 在大鼠BMSCs 中定向分化成骨中的作用， 為Sirt6 是否可作為靶向因子促進(jìn)成骨提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3～4 周齡SD 大鼠2 只，體質(zhì)量為250～300 g/只，雌雄不限，由同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國(guó)），胎牛血清（杭州四季青公司， 中國(guó)），L-抗壞血酸400 μL（Sigma公司， 美國(guó)），β 甘油磷酸鈉2 mL （Sigma 公司，美國(guó)），地塞米松20 μL（Sigma 公司，美國(guó)），ELISA 檢測(cè)試劑盒（Sigma 公司，美國(guó)），低溫冷凍離心機(jī)（盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司， 中國(guó)）， 酶標(biāo)儀（BMG LABTECH 公司，德國(guó)），Nanodrop 2000 分光光度計(jì)（Thermo 公司，美國(guó)），倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本），RT-PCR 熒光定量?jī)x（ABI 公司，美國(guó)）。 本實(shí)驗(yàn)完成于第二軍醫(yī)大學(xué)附屬公利醫(yī)院中法合作中心實(shí)驗(yàn)室。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SD大鼠BMSCs體外分離培養(yǎng)與鑒定 取SD 大鼠1 只，頸椎脫臼法處死，浸泡于75%乙醇中約5～10 min， 無(wú)菌手術(shù)器械取出雙側(cè)股骨及脛骨，去除附著肌肉，將其浸泡于適量培養(yǎng)基中。 針筒吸取適量培養(yǎng)基插入一端干骺端，將骨髓中細(xì)胞沖至培養(yǎng)皿中，反復(fù)幾次，直至股骨及脛骨發(fā)白。 收集此細(xì)胞懸液，用200 濾網(wǎng)過(guò)濾，去除稍大的雜質(zhì)，將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液收集至離心管中，800 r/min 離心5 min，棄上清液，加入適量DMEM 培養(yǎng)基混勻后接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，37 ℃、5%CO2飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)48～72 h，更換培養(yǎng)基，注意動(dòng)作輕柔。此后每隔3 d 更換培養(yǎng)基1 次。于9～12 d 后形成多個(gè)細(xì)胞集落， 長(zhǎng)滿瓶底約70%～80%后用0.25%胰酶消化，1∶2 傳代培養(yǎng)[5-6]。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、CD40、CD90、CD29 等表面分子， 其后進(jìn)行BMSCs 的誘導(dǎo)分化，證實(shí)其成骨細(xì)胞分化、脂肪細(xì)胞分化等干細(xì)胞特性。

1.3.2 CCK-8法檢測(cè)炎癥微環(huán)境下大鼠BMSCs的增殖能力 取第3 代大鼠BMSCs， 將生長(zhǎng)至70%～80%的細(xì)胞消化，離心，稀釋至1×104個(gè)/mL，在96 孔板中加入100 μL/孔細(xì)胞懸液。 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組（LPS 誘導(dǎo)組、LPS 過(guò)表達(dá)Sirt6 組）。 將合成的Sirt6 質(zhì)粒測(cè)序后轉(zhuǎn)染入BMSCs 中， 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率滿足過(guò)表達(dá)率，構(gòu)建過(guò)表達(dá)Sirt6 組，對(duì)照組不加入LPS； 實(shí)驗(yàn)組加入濃度為10 μg/mL LPS 0.1 mL/孔。分別觀察12、24、48、72 h，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。 酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度（A）值。

1.3.3 BMSCs體外多向分化能力的測(cè)定 取第3代生長(zhǎng)良好的大鼠BMSCs 以1×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%匯合時(shí)加入成骨誘導(dǎo)液，21 d 后茜素紅染色；成脂誘導(dǎo)：取第3 代生長(zhǎng)良好的BMSCs 以1×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔板中， 待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%匯合時(shí)加入成脂誘導(dǎo)液，21 d 后油紅O 染色。

1.3.4 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Sirt6蛋白的分布 取第3 代大鼠BMSCs 消化，離心，稀釋至1×104個(gè)/mL，然后接種在培養(yǎng)皿中的小蓋玻片上， 對(duì)照組加少許培養(yǎng)液。 待細(xì)胞貼壁，加足量的干細(xì)胞培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入濃度為10 μg/mL LPS 2 mL， 培養(yǎng)72 h，用丙酮在室溫下固定5 min，0.01%磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌；分別加入異硫氰酸熒光素 （fluorescein isothiocyanate， FITC）及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）標(biāo)記的Sirt6 抗體30 μL，室溫暗處孵育1 h，0.01% PBS 洗滌，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 ELISA檢測(cè)炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá) 用濃度為10 μg/mL 的LPS 刺激BMSCs，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求收集不同時(shí)間點(diǎn)（12、24、48、72 h）的細(xì)胞周圍培養(yǎng)基，使用ELISA 試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量。實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說(shuō)明書。 酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm 處時(shí)，讀A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品所制得標(biāo)準(zhǔn)曲線得到TNF-α、IL-1β、IL-6的含量值。

1.3.6 RT-PCR檢測(cè)Sirt6的mRNA表達(dá)水平 LPS誘導(dǎo)組、 對(duì)照組和LPS 過(guò)表達(dá)Sirt6 組的細(xì)胞培養(yǎng)12、24、48、72 h 時(shí)，按照TRLzol 試劑說(shuō)明書的要求提取細(xì)胞總RNA， 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書要求采用特異性下游引物法反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。Sirt6 上游 引 物：5'-AGGGTTGTCGCCATACGC-3'， 下 游 引物：5'-GGAGGACTGCCACATCAGC-3'；GAPDH 上游引物：5'-GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC-3'， 下游引物：5'-ATGAGCCCTTCCACGATGC-3'。 PCR 條件為95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃30 s、54 ℃45 s、72 ℃60 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。檢測(cè)Sirt6 的擴(kuò)增效率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取均值。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)量， 并灰度掃描進(jìn)行Sirt6 表達(dá)的半定量分析。

1.3.7 Western blot技術(shù)檢測(cè)BMSCs細(xì)胞中Sirt6的表達(dá) 分別于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)段12、24、48、72 h 時(shí)，收集對(duì)照組和LPS 誘導(dǎo)組細(xì)胞，加入去鐵胺（deferoxamine，DFO）藥物作用24 h，用預(yù)冷PBS 沖洗2 次，然后加入50 μL 細(xì)胞裂解液， 在振蕩器上震蕩數(shù)次，充分裂解后在冰上放置20 min，離心半徑5 cm、12 000 r/min 離心5 min， 收集上清液行定量分析。取已定量的總蛋白進(jìn)行12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電 泳 （SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）實(shí)驗(yàn)，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，放入5%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA），室溫封閉過(guò)夜。 取出膜，于搖床上用TBST 緩沖液洗膜3 次， 每次10 min， 加入TBST 緩沖液稀釋的Sirt6（Abcam 公司，1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 緩沖液洗膜3 次， 每次10 min， 加入辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） 標(biāo)記的羊抗兔二抗（碧云天公司，1∶2 000） 和HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠二抗（碧云天公司，1∶2 000）室溫孵育2 h。 TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min。 將膜置于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑（試劑A∶試劑B＝1∶1）中反應(yīng)2 min，取出膜，甩去多余液體，保鮮膜包好后在暗室中用X 線膠片感光、顯影、定影，凝膠分析系統(tǒng)分析蛋白的表達(dá)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行分析，2 組之間差異用t檢驗(yàn)，多組間比較則采用單因素方差分析，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs 中CD34、CD40、CD90、CD29 的表達(dá)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：CD29 的陽(yáng)性表達(dá)量＞90%，CD90 的陽(yáng)性表達(dá)量＞90%； 而CD40 的陽(yáng)性表達(dá)量＜5%，CD34 的陽(yáng)性表達(dá)量＜5%。 此結(jié)果證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs（圖1）。

2.2 CCK-8 檢測(cè)不同條件下BMSCs 的增殖情況

繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明， 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，LPS 過(guò)表達(dá)Sirt6 組細(xì)胞增殖率高于LPS 誘導(dǎo)組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖均具有逐漸增加趨勢(shì)，LPS 誘導(dǎo)組的增殖趨勢(shì)逐漸平緩（圖2）。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs 細(xì)胞標(biāo)記物Figure 1 Expression of BMSCs markers by flow cytometry

圖2 CCK-8 檢測(cè)不同條件下BMSCs 的增殖曲線Figure 2 Proliferation curves of BMSCs under different conditions by CCK-8

2.3 茜素紅和油紅O 染色測(cè)定

成骨誘導(dǎo)21 d 后，鏡下可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)形成，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞具有成骨能力（圖3A）；成脂誘導(dǎo)21 d后，可見(jiàn)明顯的脂滴狀物形成，證明細(xì)胞也具有成脂能力（圖3B）。

2.4 免疫熒光染色顯示Sirt6 的表達(dá)

BMSCs 細(xì)胞爬片上，對(duì)照組DAPI 及FITC 染色結(jié)果顯示Sirt6 蛋白的熒光表達(dá)分布 （圖3C、3D）；LPS 誘導(dǎo)組DAPI 及FITC 染色結(jié)果顯示Sirt6 在細(xì)胞爬片上的表達(dá)（圖3E、3F），證明Sirt6 在BMSCs 細(xì)胞核上呈陽(yáng)性表達(dá)。

圖3 BMSCs 的成骨、成脂分化和Sirt6 的免疫熒光表達(dá)Figure 3 Osteogenic differentiation and lipogenic differentiation of BMSCs and immunofluorescence expression of Sirt6

2.5 ELISA 檢測(cè)BMSCs 培養(yǎng)基中炎性因子TNFα、IL-1β、IL-6 的表達(dá)

圖4 炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達(dá)及Sirt6 的mRNA 水平Figure 4 Expression of inflammatory factors TNF-α、IL-1β、IL-6 and Sirt6 mRNA levels

如圖4A～C 所示，與對(duì)照組相比，同一時(shí)間點(diǎn)LPS 誘導(dǎo)組中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量均呈現(xiàn)高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)量逐漸出現(xiàn)下降趨勢(shì)（P＜0.05）。

2.6 RT-PCR 檢測(cè)Sirt6 的mRNA 水平

同一時(shí)間段內(nèi)， 相對(duì)于LPS 誘導(dǎo)組和對(duì)照組，LPS 過(guò)表達(dá)Sirt6 組中Sirt6 的mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨著時(shí)間的推移， 不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)Sirt6 的mRNA 表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4D）。

2.7 Western blot 技術(shù)檢測(cè)BMSCs 細(xì)胞中Sirt6 的表達(dá)

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示， 與對(duì)照組比較，同一時(shí)間點(diǎn)，LPS 誘導(dǎo)組中Sirt6 蛋白的表達(dá)均出現(xiàn)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著時(shí)間的推移，Sirt6 的蛋白表達(dá)并沒(méi)有出現(xiàn)顯著性下降， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot 技術(shù)檢測(cè)BMSCs 中Sirt6 的表達(dá)Figure 5 Expression of Sirt6 under different conditions by western blot

3 結(jié)論

牙周炎癥的長(zhǎng)期存在， 導(dǎo)致頜骨的廣泛吸收、牙齒松動(dòng)及脫落， 進(jìn)而面容發(fā)生炎性衰老的趨勢(shì)，影響咀嚼功能及全身營(yíng)養(yǎng)吸收。 大量的研究表明，口腔炎癥微環(huán)境和全身系統(tǒng)性疾病有著密切的關(guān)系[7-9]。 牙周炎微環(huán)境中， TNF-α、IL-1β 及IL-6 是主要的促炎因子，在炎癥反應(yīng)及骨病理、生理過(guò)程中起重要的作用，并且炎癥因子可以通過(guò)多種復(fù)雜信號(hào)通路調(diào)控干細(xì)胞的生物學(xué)特性， 例如NF-κB、Wnt/Ca+、ATK/p38-MAPK 等信號(hào)通路。 炎癥因子TNF-α 不僅可以抑制成骨細(xì)胞分化及礦化結(jié)節(jié)的形 成， 而且TNF-α 和IL-1β 在體外可以抑制BMSCs 的成脂分化能力。 本研究發(fā)現(xiàn)，同一時(shí)間點(diǎn)LPS 誘導(dǎo)組中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量均呈現(xiàn)高表達(dá)，LPS 誘導(dǎo)組中炎癥因子抑制了BMSCs 的增殖能力。然而，也有學(xué)者認(rèn)為在炎性條件下TNF-α 會(huì)刺激骨的形成，并推斷TNF-α 具有不同的功能，可能與TNF-α 的干預(yù)時(shí)間或骨形成的不同階段有關(guān)[10]。

Sirt6 是廣泛存在于哺乳動(dòng)物中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的一種組蛋白，是沉默配型信息調(diào)節(jié)蛋白家族(Sirtuin) 的重要成員。 研究表明，Sirt6 是炎癥反應(yīng)及衰老相關(guān)疾病的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，Sirt6 能夠與核因子κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）的RELA 亞型相互作用， 使NF-κB 靶基因啟動(dòng)子上組蛋白3 的賴氨酸9 （histone H3 lysine 9，H3K9） 位點(diǎn)去乙?；?， 以減弱NF-κB 的信號(hào)， 減少下游炎癥靶基因轉(zhuǎn)錄， 從而減輕細(xì)胞衰老、 凋亡及相關(guān)炎癥反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)。

Zhang 等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，熱量限制6 個(gè)月后的衰老小鼠在敲除Sirt6 后， 會(huì)誘發(fā)NF-κB 過(guò)度激活和細(xì)胞衰老加速。結(jié)果表明，抑制Sirt6 的表達(dá)，可以促發(fā)炎癥反應(yīng)，加速衰老；而過(guò)表達(dá)Sirt6 則可以抑制NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性， 抑制炎癥反應(yīng)， 延緩衰老。Lappas 等[12]利用LPS 處理臍帶內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Sirt6的表達(dá)顯著降低， 細(xì)胞內(nèi)釋放大量炎性因子（TNFα、IL-1β、IL-6）， 而過(guò)表達(dá)Sirt6 可以明顯抑制炎癥因子的表達(dá)。 本研究中，ELISA 實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)10 μg/mL LPS 刺激后可以產(chǎn)生炎癥微環(huán)境， 細(xì)胞內(nèi)可以分泌大量TNF-α、IL-1β、IL-6， 隨著時(shí)間的推移，TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達(dá)量逐漸降低，表明BMSCs具有調(diào)控炎癥因子的作用；而過(guò)表達(dá)Sirt6 后，炎癥微環(huán)境中的TNF-α、IL-1β、IL-6 出現(xiàn)了顯著性的降低，說(shuō)明Sirt6 蛋白具有抑制炎癥因子的作用。 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論。 而炎癥狀態(tài)下，過(guò)表達(dá)Sirt6 則可以提高炎癥狀態(tài)下BMSCs 的增殖速率，說(shuō)明Sirt6 也具有抑制炎性因子，并促進(jìn)BMSCs 增殖的作用。Lee 等[13]在研究人關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞時(shí)也發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Sirt6 能明顯抑制IL-1β 和TNF-α 誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，牙周炎癥微環(huán)境中大量炎性因子致使頜骨發(fā)生骨吸收與骨重塑過(guò)程。 炎癥等多種因素抑制了BMSCs 的分化和增殖能力， 成骨細(xì)胞生成數(shù)量急劇下降，破骨細(xì)胞活躍，骨破壞明顯。 抗衰老蛋白Sirt6 通過(guò)與NF-κB 的亞單位RelA/p65 直接結(jié)合而起到抑制NF-κB 活性的作用，從而實(shí)現(xiàn)抑制炎癥和抵抗衰老的雙重功能。 然而，BMSCs 中Sirt6 蛋白在調(diào)控并促進(jìn)干細(xì)胞增殖和抑制衰老等功能方面的作用，還有待于進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。