外周血白細(xì)胞和血漿中EB病毒DNA含量檢測(cè)的比較

米思蓉，張寧梅，杜偉平，何文婧

(1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 延安 716000；2.榆林市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 榆林 719000)

EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)是一種嗜人類淋巴細(xì)胞的皰疹病毒。從1964年發(fā)現(xiàn)EBV至今，被證實(shí)與EBV感染所致的疾病越來(lái)越多。EB病毒感染早期，患者一般沒(méi)有臨床癥狀，一旦進(jìn)入活動(dòng)期，可累及全身多個(gè)臟器，與淋巴瘤、傳染性單核細(xì)胞增多癥、鼻咽癌等多種疾病有關(guān)。EB病毒感染后臨床表現(xiàn)多樣，容易漏診、誤診，因此高靈敏度、高特異度的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法尤為重要。

檢測(cè)EBV感染的方法有病毒分離和鑒定、血清學(xué)檢測(cè)和EBVDNA載量檢測(cè)等[1]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)具有高靈敏度、高特異性，是目前臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)EBV的常用方法。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)選擇不同類型的標(biāo)本，對(duì)EBVDNA定量檢測(cè)的結(jié)果可能產(chǎn)生影響。本研究應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)患者外周血白細(xì)胞和血漿中的EBVDNA含量，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，探討兩者EBV含量是否存在差異，為實(shí)驗(yàn)室選擇標(biāo)本類型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年1至6月延安大學(xué)附屬醫(yī)院423例疑似EBV感染的住院及門(mén)診患者，年齡1月至66歲，男性251例，女性172例。

1.2 儀器與試劑

ABI7500PCR分析儀(美國(guó)ABI公司)。EBVDNA檢測(cè)試劑盒(PCR單管反應(yīng)體系、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性陽(yáng)性質(zhì)控品、紅細(xì)胞裂解液)購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本制備 (1)外周血白細(xì)胞分離：取出全血標(biāo)本，充分混勻全血標(biāo)本，取1 mL紅細(xì)胞裂解液加入2 mL離心管中，加入800 μL全血標(biāo)本，充分混勻，12 000 rpm/min離心1 min，去上清液。向沉淀中再加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，充分混勻，12 000 rpm/min離心3 min，去上清液。再加入1 mL生理鹽水，12 000 rpm/min離心10 min，去上清液。管底白色沉淀即為分離得到的白細(xì)胞，可用于核酸提取。(2)血漿標(biāo)本制備：取EDTA類抗凝全血離心5 min，吸取上清液，即為血漿。

1.3.2 EB病毒核酸提取 在制備好的外周血白細(xì)胞和血漿標(biāo)本中分別加入50 μL DNA提取液，充分混勻，100℃恒溫處理10 min。12 000 r/min離心5 min，留取上清液備用。

陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品分別取50 μL，加入50 μL DNA提取液，100℃恒溫處理10 min。12 000 r/min離心5 min，備用。陽(yáng)性定量參考品，混勻后短暫離心備用。

1.3.3 熒光定量PCR定量檢測(cè) 取PCR反應(yīng)管n個(gè)(n=標(biāo)本數(shù)+1管陰性質(zhì)控品+1管臨界陽(yáng)性質(zhì)控品+4管陽(yáng)性定量參考品)，分別加入處理好的標(biāo)本、陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品和陽(yáng)性定量參考品上清液各2 μL，放入PCR擴(kuò)增儀，開(kāi)始PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：93 ℃ 2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，10個(gè)循環(huán)；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)。

1.4 結(jié)果判讀

根據(jù)EBV陽(yáng)性定量參考品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線判讀結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果為典型的S型擴(kuò)增曲線且含量大于1.0×103copy/mL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，采用配對(duì)資料的符號(hào)秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性率的比較

423例患者外周血白細(xì)胞檢測(cè)EBVDNA的陽(yáng)性率為32.38%(137/423)，外周血血漿檢測(cè)的陽(yáng)性率為2.36%(10/423)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，卡方值為127，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，白細(xì)胞的EBVDNA含量陽(yáng)性率高于血漿(見(jiàn)表1)。

表1 白細(xì)胞和血漿檢出EBVDNA結(jié)果比較(n)

2.2 病毒含量的比較

同為陽(yáng)性的10例標(biāo)本，白細(xì)胞中EB病毒DNA含量明顯高于血漿，經(jīng)配對(duì)秩和檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量Z=-2.803，P=0.005(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，白細(xì)胞中EB病毒DNA含量高于血漿。且血漿為陽(yáng)性的標(biāo)本，白細(xì)胞中的EB病毒DNA含量均大于1×105copy/mL，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步明確具體的數(shù)值(見(jiàn)表2)。

表2 白細(xì)胞和血漿EB病毒DNA含量比較(copy/mL)

3 討論

EBV是較早被識(shí)別的人類腫瘤病毒，是多種惡性腫瘤的重要原因[2]，是目前人類已知的8個(gè)皰疹病毒中，最容易導(dǎo)致感染的病毒[3]，主要通過(guò)唾液和血液傳播。EB病毒感染后，首先在口腔上皮細(xì)胞內(nèi)增長(zhǎng)繁殖，然后感染局部B淋巴細(xì)胞，以環(huán)狀DNA形式游離于胞漿中，再整合到染色體內(nèi)，一旦B淋巴細(xì)胞大量進(jìn)入血液循環(huán)，即可造成全身性感染。并可長(zhǎng)期潛伏于人體淋巴組織中，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)，潛伏的EB病毒活化，機(jī)體將再次被感染。

EBVDNA水平變化是其感染及活動(dòng)與否的指標(biāo)[4]。EBV急性感染初期，只存在于淋巴細(xì)胞中，疾病沒(méi)有發(fā)展到細(xì)胞裂解程度，故外周血漿中EBVDNA含量極低，當(dāng)含量低于方法學(xué)的檢測(cè)下限，就不能被檢出[5]。EBV可以長(zhǎng)期潛伏于淋巴細(xì)胞內(nèi)，故檢測(cè)外周血白細(xì)胞，不僅可以反映現(xiàn)癥感染，也可以反映EBV感染潛伏期患者，提高了陽(yáng)性檢出率[6]。但很多血液病患者的外周血白細(xì)胞數(shù)量和功能都存在異常，這對(duì)病毒載量檢測(cè)有一定影響[7]，為臨床診斷帶來(lái)干擾。而以血漿為檢測(cè)標(biāo)本，操作簡(jiǎn)便，不易受患者白細(xì)胞數(shù)量和功能的影響，適用于白細(xì)胞異常的患者。但血漿EBVDNA含量，在感染兩周后開(kāi)始迅速下降，尤其退燒后可能檢測(cè)不到，該方法檢出病毒多為現(xiàn)癥感染，不易發(fā)現(xiàn)潛伏期感染者。兩種標(biāo)本檢測(cè)各有優(yōu)缺點(diǎn)，且有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在EBV感染相關(guān)疾病中，不同疾病對(duì)兩種標(biāo)本的敏感性也不同。如對(duì)于EBV感染相關(guān)疾病傳染性單核細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、自身免疫性疾病、上呼吸道感染和肝功能異?；颊?，檢測(cè)淋巴細(xì)胞中的EBV更敏感；對(duì)于鼻咽癌患者，檢測(cè)淋巴細(xì)胞和血漿中的EBVDNA無(wú)明顯差異[8]，所以應(yīng)該結(jié)合臨床情況，選擇更為合適的檢測(cè)標(biāo)本。本研究認(rèn)為，以外周血白細(xì)胞為檢測(cè)標(biāo)本，比血漿更為靈敏，可以減少漏診。

本研究結(jié)果顯示，用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)外周血白細(xì)胞和血漿中EBV核酸載量。外周血白細(xì)胞檢測(cè)的陽(yáng)性率高于血漿，與趙鴻，等[9]的研究結(jié)果基本一致。本次的研究結(jié)果還顯示當(dāng)白細(xì)胞中EBV的含量達(dá)到5次方以上時(shí)，血漿中EBV的含量才能被檢測(cè)出來(lái)。可能是因?yàn)楦腥境跗?，病情尚未發(fā)展到細(xì)胞裂解并釋放EBV進(jìn)入血液，故血漿中EBV含量低于檢測(cè)值下限，陽(yáng)性率較低。本研究結(jié)果與王克迪，等[7]的不一致，可能是因?yàn)檫x取的實(shí)驗(yàn)對(duì)象不一樣，而且不同實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)本處理、實(shí)驗(yàn)過(guò)程、儀器試劑也不盡相同。國(guó)內(nèi)各廠商所用工作標(biāo)準(zhǔn)品均為自主定值所得，不同試劑盒的檢測(cè)結(jié)果間可能存在較大差異[10]，使得各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果缺乏可比性。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)患者血液中EBVDNA含量的標(biāo)本有外周血白細(xì)胞、血漿和血清，其中哪一種應(yīng)作為首選標(biāo)本，尚存在爭(zhēng)論。

隨著對(duì)EBV的檢測(cè)越來(lái)越深入，EBV感染所致的疾病也越來(lái)越被重視，加強(qiáng)對(duì)感染者EBVDNA的監(jiān)測(cè)力度，將有利于了解病情的發(fā)生、發(fā)展，繼而改善治療方案。同時(shí)，為了臨床醫(yī)生工作的需要及國(guó)內(nèi)外的學(xué)術(shù)交流，除了選擇合適的檢測(cè)標(biāo)本，實(shí)現(xiàn)EBVDNA檢測(cè)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化也是未來(lái)努力的方向。