運動訓(xùn)練調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路抑制凋亡改善大鼠腦缺血再灌注損傷研究

裴騰勃，阮彩蓮，楊彥玲，成蒙蒙

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000)

在全球范圍內(nèi)，缺血性腦卒中屬于致死率和致殘率都居高不下的疾病[1]。由于大腦動脈阻塞，長時間嚴(yán)重缺血導(dǎo)致神經(jīng)細胞丟失、梗死、認(rèn)知和運動功能障礙，甚至急性死亡，且缺血后的再灌注可以通過激活炎癥反應(yīng)促進細胞凋亡使得組織損傷加重[2]。由于特定有效治療方法的局限性，為提高卒中患者生活質(zhì)量改善患者預(yù)后，探索出新的有效治療方法越來越受到人們的重視。相關(guān)研究表明，通過運動訓(xùn)練可以提高缺血再灌注大鼠存活率、減少神經(jīng)缺損、改善血腦屏障功能障礙和增加神經(jīng)血管完整性，防止更多的神經(jīng)元受到損傷可以改善腦缺血后的預(yù)后[3-4]。運動訓(xùn)練是腦卒中患者的一種治療措施，它具有神經(jīng)保護作用[5-6]。運動訓(xùn)練對人類和動物都能起到神經(jīng)保護作用。然而，神經(jīng)保護作用背后涉及的信號通路仍然沒有得到很好的證實。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),也稱AKT信號通路在細胞凋亡中起到重要的作用，PI3K/AKT途徑的激活通過增加抑制凋亡蛋白的表達，減少促凋亡蛋白的表達和細胞色素c的釋放，從而減少線粒體功能障礙和細胞凋亡[7]。然而，PI3K/AKT通路是否參與運動誘導(dǎo)的腦缺血再灌注神經(jīng)保護機制尚不清楚。因此，我們設(shè)計一系列實驗來研究運動訓(xùn)練與PI3K/AKT通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量220～280 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供。飼養(yǎng)條件:溫度(22±2)℃，濕度60%,日夜交替,自由飲水和攝食。

1.1.2 主要儀器和試劑 SLY-RTML六道動物跑臺(北京碩林苑科技有限公司)，線栓(北京西濃科技有限公司),2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)試劑(美國Sigma公司)、HE染色試劑、RIPA裂解液和BCA試劑盒(碧云天生物科技公司),Tunnel染色試劑盒(瑞士羅氏生物科技公司)，磷脂酰肌醇-3-羥激酶(Phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)、p-PI3K、AKT和p-AKT一抗(英國Abcam公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 取體重為220～280 g健康清潔級雄性SD大鼠36只隨機分為假手術(shù)組(Sham，n=12)、模型組(MCAO，n=12)和運動訓(xùn)練組(EX+MCAO，n=12)。

1.2.2 運動訓(xùn)練 運動訓(xùn)練在MCAO術(shù)后24 h開始以10 m/min的速度進行平板運動，每天30 min，跑臺坡度：0°。Sham和MCAO抓取,但不進行跑臺訓(xùn)練。

1.2.3 腦缺血再灌注損傷模型的制備 參照Longa等[8]的方法,應(yīng)用線栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。待麻醉成功后,將大鼠仰臥位固定于操作板上,減去頸部細毛并消毒,沿頸正中線切開,鈍性分離出右側(cè)頸總、頸外及頸內(nèi)動脈。結(jié)扎頸總和頸外動脈。在頸總動脈剪開一小口,將線栓由開口處插入，經(jīng)過頸內(nèi)動脈，至大腦前動脈。逐層縫合并消毒。術(shù)后將大鼠置于加熱墊上,缺血90 min后拔出線栓,再灌注24 h。假手術(shù)組大鼠只分離血管,不插栓線,其他操作相同。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 神經(jīng)功能評分 分別于造模后3 d、7 d、14 d、28 d對各組大鼠進行神經(jīng)功能學(xué)評分。參照Longa等[8]法進行神經(jīng)功能障礙評分。0分:無神經(jīng)功能活動障礙;1分:提尾時缺血側(cè)前肢不能伸展;2分:大鼠不能直行,向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走困難,行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈、傾倒;4分:嚴(yán)重意識障礙,無法行走或陷入昏迷。4分大鼠不納入實驗。

1.3.2 TTC染色測定梗死體積 造模后28 d，采用頸椎脫位處死大鼠，在20℃下快速保存20 min，借助腦切片機基質(zhì)切取2 mm厚的冠狀切片，取5片冠狀切片，在37℃下用2%的2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)染色15 min。蒼白未染色的切片被認(rèn)為是梗死區(qū)的標(biāo)志，而紅色染色的切片則是正常組織的標(biāo)志。切片固定后拍照。利用Image-proplus 6.0圖像分析軟件計算大鼠的腦梗死體積,計算梗死組織百分比(梗死腦組織百分比=梗死區(qū)體積/大腦體積)。

1.3.3 HE染色檢測組織損傷 取大鼠海馬組織石蠟切片,用二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水,蒸餾水沖洗。然后蘇木精中染色5 min,自來水沖洗切片,用鹽酸乙醇誘導(dǎo)30 s,自來水沖洗切片,用濃度梯度的酒精進行脫水,隨后放于酒精伊紅染色液中染色3 min,再次脫水處理,用二甲苯透明,最后滴加中性樹膠,進行封片。在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的病理變化。

1.3.4 Tunnel染色檢測細胞凋亡 用石蠟包埋海馬組織，制作冠狀切片(4 μm)，每個標(biāo)本切成5片。采用常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、凋亡檢測試劑盒和Tunnel法定量檢測神經(jīng)細胞凋亡。在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個視野。正常細胞核呈藍色，陽性凋亡細胞呈棕黃色，并記錄陽性凋亡細胞數(shù)。

1.3.5 Western blot法檢測 檢測大鼠腦組織PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表達情況，取腦組織研磨，制備組織勻漿。RIPA裂解液提取各組蛋白，BCA試劑盒檢測各組蛋白質(zhì)濃度。每組取30 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳分離,將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,脫脂牛奶封閉洗滌后,加一抗4℃孵育過夜,TBST洗膜。將PVDF膜封入二抗稀釋液中,室溫?fù)u床孵育1 h,TBST洗膜。滴發(fā)光液,放凝膠成像儀器內(nèi)顯影。以GAPDH為內(nèi)參，用ImageJ軟件進行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評價

MCAO組無神經(jīng)功能缺損。與MCAO組相比，與EX+MCAO組的Longa評分在各個時間點均低于MCAO組，在3 d時間點，Longa評分無明顯差異(P>0.05);在7 d時間點，Longa評分出現(xiàn)差異(P<0.05)，且在14 d和28 d時間點，EX+MCAO組Longa評分顯著降低，出現(xiàn)明顯差異(P<0.01)，提示EX+MCAO組神經(jīng)功能恢復(fù)程度好(見圖1)。

2.2 運動訓(xùn)練對MCAO大鼠腦組織梗死體積的影響

染色結(jié)果如圖2所示,白色部分表示腦梗死區(qū)域,紅色部分表示非梗死區(qū)域。與Sham組比較,MCAO組大鼠腦梗死體積顯著增加(P<0.01)。與MCAO組比較,EX+MCAO組大鼠腦梗死體積均顯著減少(P<0.01)(見封二圖2，表1)。

表1 各組大鼠腦組織梗死體積

注：*與Sham組比較P<0.01；#與MCAO組比較P<0.01

2.3 運動訓(xùn)練對MCAO大鼠腦損傷的作用

與Sham組比較,MCAO組大鼠腦組織出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)細胞變性壞死,細胞核固縮,細胞與周圍組織間隙變大,出現(xiàn)空泡變性,并伴有大量炎癥細胞浸潤;與MCAO組比較運動訓(xùn)練組大鼠細胞與組織間隙變小,空泡變性減少,炎癥細胞浸潤也顯著減少,EX+MCAO組大鼠腦組織損傷顯著減輕,細胞排列較均勻,僅有少量的細胞核固縮(見封二圖3)。

2.4 運動訓(xùn)練對MCAO大鼠神經(jīng)細胞凋亡的作用

Sham腦皮層區(qū)細胞結(jié)構(gòu)完整，未見明顯凋亡細胞。而在MCAO可以見到大量凋亡細胞，細胞的胞核固縮明顯，胞漿濃縮深染，核仁模糊，胞漿及核內(nèi)染色呈棕褐色。與Sham比較(6.58±0.22)，MCAO組大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡率(29.58±4.66)顯著升高(P<0.01,)；與MCAO組比較,EX+MCAO組大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡率(11.35±2.44)明顯降低(P<0.01,)運動訓(xùn)練能抑制MCAO大鼠神經(jīng)細胞凋亡(見封二圖4)。

2.5 運動訓(xùn)練對PI3K/AKT信號通路的作用

與Sham組相比，MCAO組p-PI3K和p-AKT的蛋白表達下降(P<0.05)；與MCAO組相比，EX+MCAO組p-PI3K和p-AKT的蛋白表達明顯上升(P<0.05);表明能運動訓(xùn)練促進MCAO大鼠大腦PI3K/AKT信號通路的激活(見圖5)。

3 討論

缺血性腦卒中是一種由于暫時停止或腦血流量不足而引起的腦部疾病。隨后的血液再灌注和復(fù)氧會進一步加重組織損傷和細胞死亡[9]。缺血性中風(fēng)由于其高致殘率和高死亡率，給患者和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。由于特定有效治療方法的局限性，因此，探索出新的有效治療缺血性腦卒中的方法越來越受到人們的重視。運動訓(xùn)練在腦缺血再灌注損傷中起重要作用，眾多研究表明運動訓(xùn)練有神經(jīng)保護作用。例如，通過運動訓(xùn)練可以提高缺血再灌注老鼠存活率、減少神經(jīng)缺損、改善血腦屏障功能障礙和增加神經(jīng)血管完整性，防止更多的神經(jīng)元受到損傷可以改善腦缺血后的預(yù)后[3-4]。

眾所周知，大鼠缺血再灌注損傷會導(dǎo)致神經(jīng)功能評分和腦梗死體積的增加，以及對正常行為結(jié)果的抑制[10]。對于神經(jīng)功能評分和腦梗死體積的檢測可有效的反映運動訓(xùn)練的神經(jīng)保護作用。在實驗中，我們發(fā)現(xiàn)MCAO組神經(jīng)功能評分顯著增加，EX+MCAO組降低了缺血再灌注引起的大鼠神經(jīng)功能評分。同時可觀察到，MCAO組的梗死體積顯著增加，運動訓(xùn)練顯著降低了缺血再灌注引起的腦梗死體積。Fang L，等證明[11]小鼠大腦腦缺血再灌注可導(dǎo)致炎癥和細胞死亡。從他們的研究結(jié)果來看，MCAO組有嚴(yán)重的神經(jīng)元丟失和神經(jīng)元死亡，胞漿減少，細胞核固縮。在我們的實驗中，HE染色結(jié)果顯示Sham組中的神經(jīng)元排列較好，但腦缺血再灌注使MCAO組神經(jīng)元核固縮，神經(jīng)元紊亂。EX+MCAO組神經(jīng)元核固縮比MCAO組明顯減少。腦缺血再灌注的大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡較多，運動訓(xùn)練可減少細胞死亡的發(fā)生。我們發(fā)現(xiàn)運動訓(xùn)練可以降低大鼠腦缺血再灌注的相關(guān)神經(jīng)元的死亡。Tunnel染色顯示MCAO組凋亡細胞明顯增多，運動訓(xùn)練組凋亡細胞明顯減少[12]。因此，運動訓(xùn)練對大鼠腦缺血再灌注相關(guān)腦損傷具有明顯的抗凋亡作用。然而，神經(jīng)保護作用背后涉及的信號通路仍然沒有得到很好的證實。

PI3K/AKT信號通路是多種神經(jīng)細胞的重要生存信號。該途徑主要涉及PI3K、AKT及其下游分子。它是細胞內(nèi)膜受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞增殖、分化、凋亡等多種過程的重要途徑。PI3K/AKT信號在腦缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵作用[13]。據(jù)報道，許多神經(jīng)保護因子，在減輕缺血再灌注損傷的過程中，可激活PI3K/AKT信號通路。例如，microRNAs通過激活PI3K/AKT信號通路對大鼠心肌缺血再灌注起保護作用[14]；高良姜素通過介導(dǎo)PI3K/AKT通路減輕大鼠肝臟缺血再灌注損傷[15]。在我們的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)MCAO組比Sham組增加p-PI3K和p-AKT的表達，與MCAO組相比運動訓(xùn)練組更能促進p-PI3K和p-AKT的表達，表明運動訓(xùn)練能明顯地激活PI3K/AKT通路。

綜上所述，運動訓(xùn)練激活PI3K/AKT信號通路抑制凋亡改善大鼠腦缺血再灌注損傷研究。