人工髖關節(jié)摩擦界面蛋白質(zhì)吸附變性分解行為及類石墨碳潤滑層形成的分子機制

經(jīng)佩佩，張悅，羅瀟雨，龔艷麗，馮慶國，冷永祥，鄧喬元

人工髖關節(jié)摩擦界面蛋白質(zhì)吸附變性分解行為及類石墨碳潤滑層形成的分子機制

經(jīng)佩佩1，張悅1，羅瀟雨1，龔艷麗1，馮慶國1，冷永祥1，鄧喬元2

（1.西南交通大學 材料科學與工程學院，成都 610031；2.海南大學 材料科學與工程學院，?？?570228）

人工關節(jié)置換術被認為是治療晚期關節(jié)炎、關節(jié)功能喪失等關節(jié)類疾病最有效和最終的治療方式。首先介紹了人工髖關節(jié)體內(nèi)服役環(huán)境特點及關節(jié)摩擦界面生物蛋白膜與類石墨碳潤滑層的形成，進一步論述了在模擬體內(nèi)服役環(huán)境下，過渡族金屬銅催化摩擦界面的蛋白質(zhì)變性降解，促進生物蛋白膜向類石墨碳潤滑層的轉(zhuǎn)變，最后探討了過渡族金屬離子介導產(chǎn)生活性氧自由基（ROS）催化蛋白質(zhì)吸附、變性、分解及生物蛋白膜、類石墨碳潤滑層形成的分子機制，并對未來陶瓷人工關節(jié)材料的設計提出展望。

人工關節(jié)；摩擦界面；生物蛋白膜；類石墨碳潤滑層；過渡族金屬；活性氧自由基

人工關節(jié)置換術是指采用金屬、高分子聚乙烯、陶瓷等材料，根據(jù)人體關節(jié)的形態(tài)、構(gòu)造及功能制成人工關節(jié)假體，通過外科技術植入人體內(nèi)，代替患病關節(jié)功能，達到緩解關節(jié)疼痛，恢復關節(jié)功能的目的。人工關節(jié)置換術被認為是治療晚期關節(jié)炎、關節(jié)功能喪失等關節(jié)類疾病最有效和最終的治療方式[1]，每年全世界范圍內(nèi)有超過100萬次關節(jié)置換手術[2]，預計到2025年全球人工關節(jié)市場將達到253.1億美元。其中，髖關節(jié)置換術是人工關節(jié)置換術中很常見的一類手術，其十年的成功率已經(jīng)超過90%。人工髖關節(jié)按關節(jié)球頭-關節(jié)臼（內(nèi)襯）配副類型主要分為金屬-高分子關節(jié)（MoP）、陶瓷-高分子關節(jié)（CoP）、金屬- 金屬（MoM）關節(jié)及陶瓷-陶瓷（CoC）關節(jié)等四 大類[3-4]。

MoP與CoP是較為常用的人工關節(jié)配副[5]，但高分子聚乙烯在長期摩擦磨損過程中會產(chǎn)生微米級聚乙烯磨屑，誘導患者骨質(zhì)溶解，導致假體松動等并發(fā)癥的發(fā)生，嚴重者需進行翻修手術[5-6]。MoM類型的人工關節(jié)具有術后關節(jié)穩(wěn)定，患者康復快的優(yōu)勢，但是MoM類型的人工關節(jié)仍然存在未解決的問 題——磨損導致的金屬離子釋放和金屬磨屑的產(chǎn)生會給患者帶來過敏、疼痛等相關并發(fā)癥，增加患者痛苦的同時還會導致假體植入失敗[7-8]。與MoP、CoP、MoM等人工關節(jié)相比，CoC類型的人工關節(jié)耐磨損性能優(yōu)異[9]，最新一代的陶瓷關節(jié)體內(nèi)磨損率為~0.16 mm3/106cycles，且抗刮擦與耐腐蝕性能好[10-11]，顯著降低了骨溶解、假體松動及感染等并發(fā)癥的發(fā)生率[12-14]，在臨床上得到越來越廣泛的應用，具有良好的市場前景。但是CoC人工關節(jié)成本較高，相對其余類型人工關節(jié)售價較為昂貴，同時存在異響及由于陶瓷韌性不足而帶來的斷裂風險，這在一定程度上限制了陶瓷關節(jié)的應用[15-16]。

人工關節(jié)的使用是為了重建關節(jié)功能，關節(jié)對摩副之間的磨損性能決定了關節(jié)的質(zhì)量及其服役壽命。人工關節(jié)主要在人體的關節(jié)腔內(nèi)服役并被體液及關節(jié)液所潤滑，關節(jié)腔內(nèi)的生理環(huán)境會影響關節(jié)的摩擦性能。人工關節(jié)置換術后，由于大部分關節(jié)囊被切除，將不再分泌或較少分泌關節(jié)液，人工關節(jié)周圍被潤滑性能較差的體液充滿，這些體液雖然潤滑性能較關節(jié)液差，但其主要成分與關節(jié)液接近，含有白蛋白、球蛋白、透明質(zhì)酸、脂質(zhì)等成分[17-19]。體液中的蛋白質(zhì)分子對摩擦過程起著重要的作用，影響植入人工關節(jié)的摩擦潤滑性能。

1 人工關節(jié)摩擦界面生物蛋白膜及類石墨碳潤滑層的形成

1.1 摩擦界面生物蛋白膜的形成

摩擦過程中，人工關節(jié)材料表面會吸附一層蛋白質(zhì)，H. Mishina[20]及Y. Yan[21]等研究發(fā)現(xiàn)，摩擦過程中金屬人工關節(jié)材料表面的吸附蛋白層在摩擦力作用下會形成生物蛋白膜，可以降低關節(jié)的摩擦及磨損，并且這層生物蛋白膜還可以在對摩副之間形成屏障，減少腐蝕性離子的運輸，降低腐蝕[21]。相比于金屬關節(jié)，陶瓷關節(jié)摩擦界面形成的生物蛋白膜雖然可以使摩擦界面在高接觸應力下仍保持非常低的摩擦[22]，但陶瓷材料表面與白蛋白親和力不強，蛋白在材料表面吸附強度較低，在卸載階段蛋白質(zhì)從表面脫出，生物蛋白膜不能穩(wěn)定存在[20,23]。

材料表面性質(zhì)（化學結(jié)構(gòu)[24]、親疏水性[25]、荷電性[26]、粗糙度[27]等）會影響蛋白質(zhì)分子在其表面的吸附狀態(tài)，如吸附量、吸附種類和構(gòu)象等。一般情況下，蛋白與極性、疏水、帶電荷、粗糙度較大的材料表面之間相互作用較強。由于蛋白結(jié)構(gòu)由氨基酸構(gòu)成，里面既有帶正電的區(qū)域，也有帶負電的區(qū)域，因此荷電材料表面蛋白吸附量較多，蛋白質(zhì)構(gòu)象容易發(fā)生變化[26]。此外，非極性材料表面的蛋白構(gòu)象也容易發(fā)生變化[28]。一般情況下，蛋白更易在疏水表面吸 附[25]，而強疏水性的表面容易破壞蛋白的構(gòu)象[29]，但是周浩等[30]發(fā)現(xiàn)白蛋白容易在親水表面吸附。

1.2 摩擦界面類石墨碳潤滑層的形成

在生理環(huán)境中，生物蛋白膜在金屬離子的催化作用下還可以進一步轉(zhuǎn)變成類石墨碳潤滑層。R. Pour-zal[31]及Y. Liao[32]等人的研究結(jié)果證明，金屬-金屬關節(jié)摩擦界面吸附的蛋白在金屬元素的催化作用下發(fā)生變性、分解，形成生物蛋白膜，隨著摩擦的進行，生物蛋白膜可以進一步轉(zhuǎn)變成類石墨碳潤滑層。如圖1所示，經(jīng)過長期的體內(nèi)摩擦過程，關節(jié)界面產(chǎn)生的摩擦層中出現(xiàn)了晶粒尺寸為幾納米、短程有序的 石墨結(jié)構(gòu)[32]。研究者認為，該摩擦層是白蛋白（C3076H4833N821O919S42）消除N、S、O元素之后的產(chǎn)物，主要含有C、H兩種元素，其組成比例為3076∶448。此外，電子能量損失譜（EELS）結(jié)果顯示，該摩擦層中石墨碳的原子百分比為82%，內(nèi)部含有大量的石墨結(jié)構(gòu)，因此該摩擦層是具有良好潤滑性能的類石墨碳潤滑層。雖然關于類石墨碳潤滑層的形成機制還有待研究，但可以肯定的是，一些過渡族金屬可以作為催化劑，促進類石墨碳潤滑層的形成[32]。

圖1 摩擦層的高分辨電子圖譜[32]

本團隊研究結(jié)果證明了Cu金屬可以催化白蛋白在摩擦界面吸附、變性、分解并形成類石墨碳潤滑 層[33]。比較Cu/Al2O3與CoCrMo/Al2O3兩種對摩副在牛血清白蛋白（BSA）溶液中的摩擦行為發(fā)現(xiàn)，相比于CoCrMo合金，過渡族金屬Cu可以促進磨痕內(nèi)部對BSA分子的吸附。如圖1所示，圖中綠色熒光代表被熒光蛋白標記的BSA分子，可以發(fā)現(xiàn)，在沒有摩擦磨損作用的情況下（圖2a），Cu表面吸附的BSA分子呈現(xiàn)隨機分布的狀態(tài)；摩擦磨損作用后（圖2b），大量BSA分子被吸附到Cu金屬表面的磨痕中。利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-OES）檢測到摩擦磨損完畢后，溶液中的Cu離子質(zhì)量濃度為0.0965 μg/mL，說明摩擦磨損釋放的銅離子可以促進磨痕內(nèi)部對BSA分子的吸附，促進生物蛋白膜的形成。

圖2 Cu金屬表面熒光標記蛋白圖像[33]

Cu表面吸附的蛋白質(zhì)分子在Al2O3球頭的剪切作用下，結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，分子量降低。如圖3所示，Cu磨痕處蛋白膜的蛋白印跡結(jié)果出現(xiàn)了明顯的拖尾現(xiàn)象，表明Cu/Al2O3摩擦副在摩擦磨損過程中可以促使摩擦界面的BSA分子轉(zhuǎn)變成分子量更小的物質(zhì)（發(fā)生變性分解）。進一步采用Raman光譜分析磨斑，結(jié)果如圖4所示，與CoCrMo/Al2O3對摩副相比，Cu/Al2O3對摩副的磨損區(qū)域中出現(xiàn)類石墨碳薄膜的拉曼信號——D峰和G峰，表明在Cu-Al2O3摩擦界面形成了類石墨碳潤滑層，這層類石墨碳潤滑層來源于摩擦界面的蛋白質(zhì)降解。

綜上所述，相比于CoCrMo合金，過渡族金屬Cu具有更好的催化摩擦界面產(chǎn)生類石墨碳潤滑層的能力，其催化機理如圖5所示。首先Cu/Al2O3摩擦副之間的摩擦磨損作用會釋放Cu離子，釋放的Cu離子會和溶液中的BSA分子結(jié)合，促進BSA分子吸附到磨痕界面處，吸附到磨痕處的蛋白分子會逐漸形成一層生物蛋白膜，這層生物蛋白膜在金屬離子的催化作用和摩擦副的剪切作用下，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楦惶嫉念愂紳櫥瑢覽33]。

圖3 干燥BSA分子和Cu磨痕處蛋白膜的蛋白印跡檢測結(jié)果[33]

圖4 干燥BSA分子與不同金屬磨痕內(nèi)外的拉曼光譜[33]

圖5 過渡族金屬Cu摩擦界面處形成類石墨碳潤滑層示意圖[33]

1.3 小結(jié)

本節(jié)介紹了人工髖關節(jié)摩擦界面生物蛋白膜與類石墨碳潤滑層的形成，并且研究證明過渡族金屬離子可以催化摩擦界面生物蛋白膜向類石墨碳潤滑層的轉(zhuǎn)變。但是關于過渡族金屬離子催化蛋白質(zhì)變性的分子作用機制及生物蛋白膜、類石墨碳潤滑層的形成與轉(zhuǎn)變機制，目前并沒有研究者提出詳細的解釋，仍需要進一步的研究。

2 過渡族金屬離子-ROS-蛋白質(zhì)分子作用機制

2.1 過渡族金屬離子與蛋白作用

金屬離子對蛋白的正常功能性以及生物蛋白膜的產(chǎn)生有著十分重要的作用。大部分哺乳動物蛋白包含四個金屬結(jié)合位點[34]，即N基位點（NBS）、Cyr34殘基、多金屬結(jié)合位點（MBS）與非定位位點B（Site B）。過渡族金屬離子可通過一種或多種結(jié)合位點與蛋白質(zhì)配位結(jié)合，蛋白質(zhì)的側(cè)鏈或官能團可以折疊圍繞金屬離子，形成特定的空間構(gòu)型。如表1所示，Cu(II)與Ni(II)可通過NTS與MBS位點與血清白蛋白結(jié)合，形成四方平面空間構(gòu)型[35-39]；Zn(II)可通過MBS位點與血清白蛋白結(jié)合，形成五配體空間構(gòu)型[40]；Co(II)可通過NTS、MBS與Site B位點與血清白蛋白結(jié)合，形成八面體空間構(gòu)型[41]。

表1 過渡族金屬離子與人血清蛋白質(zhì)的結(jié)合

Tab.1 Binding of transition metal ions to human serum proteins (HSA)

過渡族金屬離子會誘導生物蛋白膜的形成。一方面，過渡族金屬離子，如Cu(II)，可以誘導蛋白質(zhì)主鏈伸展，使蛋白質(zhì)中α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，β-折疊結(jié)構(gòu)增多[43]，變性后的蛋白質(zhì)分子從原來有序、卷曲緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o序、松散伸展狀結(jié)構(gòu)，從而使蛋白質(zhì)內(nèi)部殘基（如Trp殘基）的疏水基團裸露出來，疏水性增加，導致聚集沉降；另一方面，金屬離子具有橋聯(lián)作用，可通過金屬離子-蛋白結(jié)合位點與蛋白質(zhì)配位結(jié)合，誘導蛋白交聯(lián)網(wǎng)絡的形成。在摩擦力的協(xié)同作用下，最終形成一層生物蛋白膜。

2.2 過渡族金屬離子催化蛋白質(zhì)變性分解機制

研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)會在過渡族金屬的催化作用下發(fā)生變性、分解，最終將生物蛋白膜轉(zhuǎn)變?yōu)轭愂紳櫥瑢覽32,33]。過渡族金屬有空的d軌道或者d軌道電子，在化學反應中可以提供空軌道充當親電試劑，或者提供孤對電子充當親核試劑，形成中間產(chǎn)物，降低反應活化能，促進反應進行。因此，過渡族金屬可以作為無機催化劑介導催化反應，產(chǎn)生活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）。有研究表明，過渡族金屬離子（如Fe2+）可以催化多肽及醇溶蛋 白（C-hordein）產(chǎn)生活性氧自由基（如羥基自由基（HO?））[44]。

自由基是體內(nèi)各種生化反應的中間代謝產(chǎn)物，對維持機體的正常代謝有特定的促進作用[45-46]，可以增強白細胞的吞噬功能，提高殺菌效果，并參與前列腺素、脂肪加氧酶、膠原蛋白、凝血酶原等一系列酶與激素的合成，通常情況下，體內(nèi)自由基處于不斷產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡之中[47]。由于活性氧自由基（ROS）含有未配對的電子，因而具有高度的活潑性和極強的氧化反應能力[48]，能通過氧化作用使體內(nèi)的蛋白質(zhì)生物大分子變性分解。

ROS水解蛋白質(zhì)的反應過程如圖6所示，ROS容易奪取蛋白質(zhì)主鏈α-C上的H原子，產(chǎn)生以碳為中心的自由基（產(chǎn)物②），再與O2反應生成烷過氧自由基（產(chǎn)物③）[49]。一方面，烷過氧自由基可通過脫除氫過氧自由基（HO2?）形成亞胺（產(chǎn)物④），亞胺不穩(wěn)定，容易水解成酰胺（產(chǎn)物⑤）和羰基化合物（產(chǎn)物⑥），使蛋白質(zhì)主鏈斷裂[50]；另一方面，烷過氧自由基可從其余反應物中奪取氫原子，生成氫過氧化物（產(chǎn)物⑦），經(jīng)由單電子還原過程轉(zhuǎn)變?yōu)橥檠踝杂苫óa(chǎn)物⑧），烷氧自由基進一步分解為羰基化合物（產(chǎn)物⑨）和酰基自由基（產(chǎn)物⑩），導致主鏈斷裂[51]。其中反應生成的氫過氧自由基（HO2?）、烷基自由基（R?）以及?；杂苫óa(chǎn)物⑩）會繼續(xù)和蛋白質(zhì)的主鏈作用，產(chǎn)生更多自由基，參與反應，進而發(fā)生級聯(lián)反應，水解蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)生物大分子的主鏈逐級斷裂后形成低分子量多肽或氨基酸單體，在摩擦剪切力的作用下，多肽或氨基酸可能會繼續(xù)裂解，形成小分子基團。

圖6 活性氧自由基水解蛋白質(zhì)的反應過程

本研究團隊利用分子動力學模擬計算氨基酸在過渡族金屬Cu表面的吸附、斷鍵過程，結(jié)果如圖7所示，氨基酸分子在過渡族金屬Cu表面吸附穩(wěn)定，并且在摩擦力作用下，Cu可以促進氨基酸裂解成小分子片段，其中裂解的部分小分子片段會和Cu表面形成強化學結(jié)合，這些吸附在Cu表面的含碳小分子片段為最終在摩擦界面形成類石墨碳潤滑層提供了碳源[52]。

圖7 Cu表面天冬氨酸在剪切力作用下分子動力學模擬[52]

2.3 小結(jié)

本節(jié)所提出的過渡族金屬離子催化生物蛋白膜及類石墨碳潤滑層形成的分子機制如下：①過渡族金屬離子誘導蛋白質(zhì)主鏈伸展，促進蛋白聚集沉降；②過渡族金屬離子具有橋聯(lián)作用，與蛋白質(zhì)配位結(jié)合誘導蛋白交聯(lián)網(wǎng)絡的形成。在摩擦力的協(xié)同作用下，摩擦界面形成一層生物蛋白膜。在長期的摩擦過程中，過渡族金屬離子介導產(chǎn)生的活性氧自由基（ROS）水解蛋白質(zhì)，通過級聯(lián)反應使蛋白質(zhì)主鏈斷裂，蛋白質(zhì)從高階結(jié)構(gòu)逐漸裂解成多肽或氨基酸等低階結(jié)構(gòu)。在摩擦力的共同作用下，氨基酸等低階結(jié)構(gòu)進一步裂解成小分子片段，并與過渡族金屬表面形成強化學結(jié)合，在摩擦力持續(xù)作用下，最終在材料表面形成一層類石墨碳潤滑層，實現(xiàn)材料體內(nèi)自潤滑功能。

3 總結(jié)與展望

本文針對體內(nèi)服役過程中人工關節(jié)摩擦界面處會形成生物蛋白膜，并且在金屬元素的催化作用下，生物蛋白膜還可進一步轉(zhuǎn)變成類石墨碳潤滑層的現(xiàn)象，研究證明金屬銅離子可以催化蛋白質(zhì)變性分解，促進生物蛋白膜向類石墨碳潤滑層的轉(zhuǎn)變。在此基礎上，本文揭示了過渡族金屬離子介導產(chǎn)生活性氧自由基（ROS）催化蛋白質(zhì)變性分解及生物蛋白膜、類石墨碳潤滑層形成的分子機制。

隨著年輕患者的增加以及人口老齡化的加劇，患者對人工關節(jié)有著高質(zhì)量和長壽命的要求。陶瓷關節(jié)由于其優(yōu)異的耐磨損、耐腐蝕性能開始逐漸占據(jù)關節(jié)市場，但陶瓷關節(jié)仍存在碎裂、異響等臨床并發(fā)癥，這是制約其發(fā)展的關鍵因素。陶瓷關節(jié)摩擦界面潤滑狀態(tài)差（界面潤滑不足、潤滑層?。┖吞沾申P節(jié)材料力學性能不足是導致其臨床并發(fā)癥的主要原因。針對陶瓷關節(jié)體內(nèi)服役的生理環(huán)境特點（存在白蛋白、球蛋白等生物分子），通過向陶瓷材料中摻雜過渡族金屬元素（Cu、Mn等），利用金屬離子介導體內(nèi)白蛋白、球蛋白等生物分子在材料表面的吸附、變性、分解，在摩擦剪切力及金屬離子催化作用下，生物分子在摩擦界面形成生物蛋白膜，隨著摩擦的進行，生物蛋白膜轉(zhuǎn)變?yōu)轭愂紳櫥瑢?。生物蛋白膜及類?墨碳潤滑層可以潤滑摩擦界面，改善陶瓷材料摩擦 界面潤滑狀態(tài)，降低界面摩擦系數(shù)及界面接觸應力，減輕界面磨損。另外，通過金屬摻雜也可以提高摩擦界面潤滑層的厚度，降低界面接觸應力及界面磨損，抑制磨損裂紋形成及擴展，降低材料的韌性需求和 陶瓷假體破損、異響發(fā)生風險，提高陶瓷人工關節(jié)的質(zhì)量。

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Adsorption, Denaturation and Decomposition of Proteins in Friction Interface for Artificial Hip Joint and Molecular Mechanism of Formation of Graphite-like Carbon Lubrication Layer

1,1,1,1,1,1,2

(1.School of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China; 2.School of Materials Science and Engineering, Hainan University, Haikou 570228, China)

Artificial joint replacement is considered to be the most effective and ultimate treatment for joint diseases such as advanced arthritis and joint dysfunction. The in vivo service environment characteristics of artificial hip joint, and the formation of biofilm and graphite-like carbon lubrication layer in friction interface were introduced firstly. The denaturation and de-gradation of proteins at the friction interface catalyzed by transition metal copper under the simulated in vivo service environment were further discussed and the transformation from biofilm to graphite-like carbon lubrication layer was also investigated. The molecular mechanism of transition metal ions producing reactive oxygen species, catalyzing the adsorption, denaturation and decomposition of proteins and forming biofilm, graphite-like carbon lubrication layer was studied, and the design of ceramic artificial joint material was prospected.

artificial joint; frictional interface; biofilm; graphite-like carbon lubrication layer; transition metal; reactive oxygen species

2020-06-12；

2020-06-18

JING Pei-pei (1995—), Female, Doctor, Research focus: surface engineering.

冷永祥（1972—），男，博士，教授，主要研究方向為離子束表面改性。郵箱：yxleng@263.net

Corresponding author：LENG Yong-xiang (1972—), Male, Doctor, Professor, Research focus: ion beam surface modification. E-mail: yxleng@ 263.net

通訊作者：鄧喬元（1991—），男，博士，講師，主要研究方向為表面工程。郵箱：qydeng@hainanu.edu.cn

Corresponding author: DENG Qiao-yuan (1991—), Male, Doctor, Lecturer, Research focus: surface engineering. E-mail: qydeng@hainanu. edu.cn

經(jīng)佩佩, 張悅, 羅瀟雨, 等. 人工髖關節(jié)摩擦界面蛋白質(zhì)吸附變性分解行為及類石墨碳潤滑層形成的分子機制[J]. 表面技術, 2020, 49(6): 52-59.

R318.08

A

1001-3660(2020)06-0052-08

10.16490/j.cnki.issn.1001-3660.2020.06.006

2020-06-12；

2020-06-18

國家自然科學基金（31570958）

Fund：Supported by the National Natural Science Foundation of China (31570958)

經(jīng)佩佩（1995—），女，博士，主要研究方向為表面工程。

JING Pei-pei, ZHANG Yue, LUO Xiao-yu, et al. Adsorption, denaturation and decomposition of proteins in friction interface for artificial hip joint and molecular mechanism of formation of graphite-like carbon lubrication layer[J]. Surface technology, 2020, 49(6): 52-59.