高壓氧對人膠質(zhì)瘤172細(xì)胞生存的影響

于秋紅，李冬果，張琪，任梓齊，嵇江淮，劉亞玲，王叢，薛連璧

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，約占腦腫瘤的50%左右，手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率高，術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因為腫瘤殘留[1]，而擴(kuò)大切除范圍則意味著腦功能的損傷，部分患者術(shù)后出現(xiàn)昏迷、偏癱、失語等，給患者、家庭及社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。最大程度地切除腫瘤還是保留更多的腦功能經(jīng)常是臨床醫(yī)生面臨的難題。在腦血管病[2-3]、腦外傷等疾病的康復(fù)治療階段，醫(yī)生會選擇高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)治療，但在選擇腫瘤切除術(shù)后患者的康復(fù)方案時，采用HBO治療會格外謹(jǐn)慎。雖然有報道稱HBO治療結(jié)合放射性治療和化學(xué)療法會增強治療效果[4-5]，減小腫瘤體積、減慢腫瘤生長速度，但單獨HBO治療作用于腫瘤細(xì)胞結(jié)果不一，有關(guān)HBO治療惡性腫瘤的作用尚未形成定論[6-7]。HBO是否會促進(jìn)腫瘤生長這一顧慮，在很大程度上妨礙了HBO的臨床應(yīng)用。本研究采用臨床經(jīng)常應(yīng)用的HBO治療方案處理人膠質(zhì)瘤172細(xì)胞，觀察HBO暴露對細(xì)胞生存的影響，以期望對臨床安全用氧提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗用細(xì)胞株：人腦膠質(zhì)瘤172細(xì)胞由神經(jīng)外科同事惠贈，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。按常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的改良eagle培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長狀況換液、傳代。試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)，多聚賴氨酸、四甲基偶氮唑藍(lán)(Sigma公司進(jìn)口分裝)，二甲基亞砜(北京索萊寶科技有限公司)。設(shè)備及儀器：氧艙使用上海減壓器廠生產(chǎn)的透明實驗艙，流式細(xì)胞儀(美國BD公司FACS Verse)、 切片機(jī)(Leica EM UC6切片機(jī))、透射電子顯微鏡(HITACHI-7650)。

1.2 方法 取對數(shù)生長期的172膠質(zhì)瘤細(xì)胞隨機(jī)分為對照組和HBO組，對照組細(xì)胞每日在實驗艙中置于常壓0.1MPa空氣中90min，其余時間置于培養(yǎng)箱中，根據(jù)細(xì)胞生長情況換液、傳代等，無特殊處理；HBO組穩(wěn)壓壓力為0.2MP，每日HBO暴露1次，共暴露10次，暴露方案具體如下：將膠質(zhì)瘤細(xì)胞置于實驗艙中，氧氣加壓，15min升壓至0.2MPa，穩(wěn)壓1h，減壓15min，其余時間培養(yǎng)同對照組。

1.3 檢測指標(biāo) HBO暴露10次后繼續(xù)培養(yǎng)1d，第11d收集2組細(xì)胞，每組細(xì)胞觀察如下指標(biāo)：①細(xì)胞計數(shù)：選取處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)佳且無明顯懸浮狀態(tài)的細(xì)胞，按傳代步驟得到單細(xì)胞懸液，通過細(xì)胞計數(shù)板顯微鏡下計數(shù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)目。②細(xì)胞凋亡比例：根據(jù)磷脂結(jié)合蛋白Annexin V和7-氨基-放線菌素D (7-amino-actinomycin D，7-AAD)親和部位及能力不同，用流式細(xì)胞儀(BD FACS Verse)檢測熒光強度來檢測細(xì)胞早期及晚期凋亡情況，此過程重復(fù)3次。③生長周期：根據(jù)不同脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)量結(jié)合的熒光染料量不同，用流式細(xì)胞儀檢測熒光強度來反映細(xì)胞增殖狀況，用BD公司MODFIT軟件分析，此過程重復(fù)3次。④超微結(jié)構(gòu)：透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞計數(shù) 2組對數(shù)生長期的172膠質(zhì)瘤細(xì)胞都貼壁生長，無明顯懸浮死亡細(xì)胞，對照組細(xì)胞計數(shù)(4.19±0.09)×105個，HBO組計數(shù)(4.03±0.07)×105個，HBO組細(xì)胞計數(shù)明顯少于對照組(t=3.2，P=0.01)。

2.2 2組凋亡細(xì)胞比例 本研究用AnnexinV與7-AAD進(jìn)行細(xì)胞染色，AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故早期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)AnnexinV染色陽性(Annexin V+/7-AAD-)，晚期凋亡細(xì)胞則染色呈現(xiàn)雙陽性(Annexin V+/7-AAD+)。HBO組早期和晚期凋亡細(xì)胞比例均明顯高于對照組(均P<0.01)，見表1。

表1 2組凋亡細(xì)胞比例

2.3 細(xì)胞生長周期 HBO組G1期細(xì)胞比例為(57.26±3.56)%，對照組為(59.48±5.32)%，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.780，P=0.460)；HBO組S期細(xì)胞比例為(40.91±5.37)%，對照組為(35.23±5.31)%，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.680，P=0.130)；HBO組G2期細(xì)胞比例(1.2±0.26)% 較對照組(5.41±0.86)%明顯減少(t=10.420，P<0.01)。此外，HBO組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和死亡細(xì)胞(綠色圖例)，其比例約占6.8%，見圖1a～b 。

2.4 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 對照組細(xì)胞周圍突起密集、細(xì)長，而HBO組細(xì)胞突起較對照組減少，形狀短小，見圖2a～b。

3 討論

Nature雜志曾發(fā)表了天主教魯汶大學(xué)的研究結(jié)果[8]，研究分析了3000多例患者腫瘤樣品，發(fā)現(xiàn)當(dāng)氧氣缺乏時，甲基基團(tuán)過度的添加到DNA上。超甲基化這種表觀遺傳(不影響遺傳密碼，但強烈干擾基因功能)阻止腫瘤的抑制基因表達(dá)，因而能夠讓細(xì)胞產(chǎn)生異常行為，導(dǎo)致腫瘤過度生長。而在小鼠體內(nèi)，當(dāng)腫瘤的血液供應(yīng)正常化時，可以阻止這些表觀遺傳變化。實驗室人員也正在開展聚焦于血管正?；煼ǖ男卵芯?。

常壓下機(jī)體主要依靠血紅蛋白輸送氧氣，治療無疑受制于血管正常，而高壓氧則是增加物理溶解氧，只要有液體存在的地方就能有氧氣供應(yīng)，無疑能很好的解決缺氧的問題。最近Science雜志發(fā)表了Chakraborty等[9]的研究，證實組蛋白脫甲基酶KDM6A(histone demethylase，KDM6A)具有直接感受環(huán)境缺氧的能力，它的減少或缺失就像缺氧一樣可以直接阻止組蛋白H3賴氨酸27(Histone H3 lysine 27，H3K27)的去甲基化，與前文的缺氧導(dǎo)致超甲基化異曲同工。在缺氧細(xì)胞中補充KDM6A可以恢復(fù)H3K27的甲基化平衡。這表明氧可以直接影響染色體調(diào)整因子，控制細(xì)胞命運。基于此，本研究擬將膠質(zhì)瘤172細(xì)胞作HBO處理，觀察腫瘤細(xì)胞生長情況，電鏡下觀察腫瘤細(xì)胞微結(jié)構(gòu)。與Selvendiran 等[10]從卵巢癌得出的結(jié)論相似，本研究發(fā)現(xiàn)HBO暴露后膠質(zhì)瘤172生長速度也減慢。蘭川等[11]和趙秀文等[12]的研究亦提示GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞HBO培養(yǎng)后細(xì)胞繁殖能力下降、細(xì)胞計數(shù)減少。這些都提示HBO并沒有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。此外，本研究提示HBO暴露后膠質(zhì)瘤172細(xì)胞更多的阻滯在S期，這與凋亡細(xì)胞染色結(jié)果的趨勢是一致的，HBO使G2期細(xì)胞減少，有將細(xì)胞阻滯在S期的趨勢，并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這與蘭川等[11]和趙秀文等[12]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBO培養(yǎng)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞更多的阻滯在G0～G1期不同，考慮原因一是HBO暴露方式不同，本研究是常規(guī)培養(yǎng)，采用臨床常用HBO劑量進(jìn)行暴露，而蘭川等[11]的研究則是將膠質(zhì)瘤細(xì)胞一直在高壓高氧環(huán)境中培養(yǎng)，造成二者HBO暴露劑量不同；另外研究采用的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系不同，不排除這也可能造成結(jié)果差異。

此外，值得注意的是，張偉等[13]觀察到結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞在應(yīng)用0.2MPa的HBO暴露且在暴露后24h時，細(xì)胞積聚在S期最明顯，此時應(yīng)用細(xì)胞周期特異性化療藥物氟尿嘧啶，可顯著增強藥物效果，且濃度越低顯效越早，考慮可能是采用高濃度藥物早期即可達(dá)治療效果，而低濃度藥物本身不足以達(dá)到治療效果，聯(lián)合應(yīng)用HBO后隨時間延長才顯示聯(lián)合應(yīng)用更優(yōu)的效果。這些都提示我們臨床中更應(yīng)注意HBO的劑量和治療時間窗，根據(jù)病理結(jié)果，選取合適的HBO劑量在不同的時期介入，可能會影響化療藥物的選擇。進(jìn)行個性化的精準(zhǔn)治療，可能有助于減小藥物劑量，減輕毒副作用，使患者預(yù)后更佳。

正是實體腫瘤內(nèi)部的缺氧微環(huán)境，在腫瘤的惡性進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用[8,14-15]。而HBO作為唾手可得的糾正缺氧的物理治療，理應(yīng)得到更多的關(guān)注。除了增加血腦屏障開放、促進(jìn)化療藥物進(jìn)入腫瘤組織[16]，本研究再一次證實HBO本身對腫瘤細(xì)胞也產(chǎn)生了一定的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是機(jī)制之一。與腦梗死大鼠HBO治療改善缺氧，使細(xì)胞存活而凋亡減少不同[17-18]，本研究提示HBO使得膠質(zhì)瘤凋亡細(xì)胞增加，這與萬文武等[19]的研究結(jié)果是相符的，考慮HBO使得凋亡細(xì)胞增加，從而壞死細(xì)胞相對減少，減輕能量消耗，阻斷了腫瘤進(jìn)一步缺氧。HBO已逐漸成為一種治療基礎(chǔ)疾病過程及疾病本身的藥物[20]。

目前的研究認(rèn)為腫瘤組織中存在腫瘤干細(xì)胞，具有強烈的增殖能力和自我更新能力[21]，并能分化成子代腫瘤細(xì)胞，保持腫瘤的不斷生長，是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，而這種能力與細(xì)胞表面的突起有關(guān)，可能涉及到多種微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，MicroRNA)的作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)HBO暴露后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面突起短縮，數(shù)量減少，考慮腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移能力下降。這可能和HBO影響了細(xì)胞的MicroRNA有關(guān)，我們正在進(jìn)行相關(guān)研究。

總之，細(xì)胞增殖、凋亡和DNA損傷等，是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及決定癌細(xì)胞對放射或化療藥物敏感性的重要分子病理學(xué)基礎(chǔ)。本研究顯示：HBO減慢了腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使更多的細(xì)胞阻滯在S期，使與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)的突起變短、減少，初步顯示了HBO對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。我們正在進(jìn)一步的研究，以便對臨床安全用氧提供更多的理論依據(jù)。