石蠟切片免疫組化套染PAS在腎活檢組織病理診斷中的應用

弓玉祥，陳平圣,2，楊旻宇

在腎穿刺組織的病理診斷中，采用常規(guī)冷凍切片免疫熒光染色、石蠟切片HE染色、PAS染色、Masson染色、PASM染色以及電鏡觀察，以得到準確的病理診斷。但由于腎穿刺為有創(chuàng)性檢查，再加上術者技術精疏有別以及患者個體差異，不僅所取組織十分細小，而且標本質量亦常不盡人意；另外，沒有能力購置電鏡的單位難以做超微診斷。因此需要我們摸索新的方法，以達到最大限度獲得疾病信息，同時又省時、省力，且節(jié)約成本。作者實驗室前期已經建立了石蠟切片免疫熒光染色法，其他學者也有相關報道[1-3]。最近又建立了腎活檢組織石蠟切片免疫組化結合PAS染色方法，取得了較好的效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2003年以來東南大學附屬中大醫(yī)院腎內科住院患者及外院送檢標本，經腎活檢組織診斷IgA腎病和膜性腎病的患者標本合計70例，進行回顧性分析。

1.2 實驗試劑0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0)、0.5%過碘酸、10%冰醋酸、5%鹽酸乙醇、5%氨水乙醇、PAS染液、蘇木精染液，均為本實驗室自制。粉劑型抗原修復原液[檸檬酸法pH (6.0±0.1)]購自福州邁新公司。FITC標記的兔抗人IgA、IgG多克隆抗體(稀釋倍數1 ∶40)；兔抗人IgA、IgG多克隆抗體(即用型)、內源性過氧化物酶阻斷試劑(即用型)、酶標羊抗兔抗體(即用型)、胰酶(即用型)，均購自北京中杉金橋公司。DAB顯色試劑盒(即用型)購自福州邁新公司。

1.3 實驗儀器透射電鏡(日立公司，日本)；熒光顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)；冷凍切片機(徠卡公司，德國)；恒溫水浴箱(國產)。

1.4 標本制備腎活檢標本按常規(guī)方法分別制作冷凍切片、石蠟切片和超薄電鏡切片。冷凍切片厚4 μm，石蠟切片厚2 μm。制作過程中，組織經10%中性福爾馬林于4 ℃冰箱中固定4～48 h，常規(guī)脫水，浸蠟時間不超過4 h，溫度控制在60～62 ℃。

1.5 染色方法冷凍切片免疫熒光染色采用一步法[2]。免疫組化套染PAS步驟如下：(1)石蠟切片二甲苯脫蠟2次，每次20 min，80%～100%梯度乙醇至水，每次均為5 min。(2)微波熱修復抗原，切片浸泡于檸檬酸緩沖液中，中火4 min，?；? min，后低火4 min，將切片自微波爐中取出，自然冷卻至室溫；置于PBS緩沖液中，3 min×2次，再將切片滴加胰酶，37 ℃孵育15 min，進一步暴露抗原，PBS浸泡3次，每次3 min。(3)加內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min，PBS浸泡3次，每次3 min。(4)加兔抗人IgA或IgG抗體，37 ℃孵育60 min，PBS浸泡3次，每次3 min。(5)加酶標二抗，室溫孵育20 min，PBS浸泡3次，每次3 min。(6)加新鮮配置的DAB顯色劑5～8 min，自來水洗。(7)加0.5%過碘酸10 min，自來水洗，自來水浸泡5 min。(8)加PAS染液20 min，自來水洗，浸泡蒸餾水中10 min。(9)2 mol/L H2SO4酸化2 min，水洗。(10)加蘇木精染色液15 min，自來水洗，5%鹽酸乙醇1～2 min，自來水洗，5%氨水乙醇1～2 min，自來水洗。(11)梯度乙醇脫水，透明，封固。

2 結果

膜性腎病組織免疫熒光染色顯示翠綠色顆粒狀熒光沿腎小球毛細血管壁分布；電鏡下見腎小球毛細血管基膜外上皮下團塊狀電子致密物沉積。IgA腎病組織顯示腎小球系膜區(qū)團塊狀或鹿角狀綠色熒光，電鏡下見系膜區(qū)團塊狀電子致密物沉積。套染切片組織結構清晰，色彩鮮艷；免疫復合物呈團塊狀或顆粒狀沉積在腎小球系膜區(qū)或毛細血管壁，沉積部位和方式與冷凍切片免疫熒光及電鏡觀察一致；組織結構與單純PAS染色相似，細胞核著色稍淺(圖1、2)。

3 討論

腎穿刺活檢病理診斷是腎臟疾病診斷的金標準，是臨床有效治療的基石，而準確的病理診斷依賴于可靠的技術支撐[4]。活檢組織量盡管很少，但是為了準確診斷，必須把組織制備成冷凍切片、石蠟切片和電鏡超薄切片，再進行各種染色以備觀察[5]。

圖1膜性腎病組織不同染色方法比較：A.冷凍切片免疫熒光染色；B.單純PAS染色；C.電鏡；D.免疫組化+PAS套染圖2IgA腎病組織不同染色方法比較：A.冷凍切片免疫熒光染色；B.單純PAS染色；C.電鏡；D.免疫組化+PAS套染

石蠟切片HE染色用于觀察腎組織的基本結構，分辨細胞種類；PAS染色可用于觀察腎小球和腎小管基膜以及系膜基質的多寡，還可用于特殊病原體的檢測[6]；Masson染色可顯示基膜及細胞外基質增多，用于觀察腎間質纖維化及某些特殊蛋白沉積，如免疫復合物。冷凍切片免疫熒光染色用于檢測沉積于腎組織內免疫球蛋白、補體、纖維蛋白以及病毒抗原等。借助電鏡可觀察腎臟超微結構改變，如腎小球基膜厚度和結構、腎臟固有細胞形態(tài)、電子致密物及其沉積部位、特殊的纖維素樣物質和病毒樣顆粒等。

然而，在臨床實際工作中，常因檢材太少或條件有限，難以進行上述各種檢查，增加了診斷的不確定性。作者通過反復摸索，成功建立了免疫組化與PAS套染方法。與單純PAS染色、直接免疫熒光染色和電鏡觀察作對比，無論組織結構、免疫復合物沉積的方式、部位等方面均取得了滿意效果。因此，作者認為該方法可以在缺少免疫熒光和電鏡標本或兩種樣品缺少腎小球的情況下使用，兼具PAS染色、免疫熒光染色和電鏡檢查的部分功能，克服了PAS染色只能顯示組織的顯微結構、免疫熒光只檢測抗原沉積、電鏡觀察范圍太小等不足，初步起到確定診斷的作用，同時還節(jié)約了檢材、制樣及觀察時間。另外該方法也可在沒有經費購買電鏡、熒光顯微鏡、冷凍切片機的普通醫(yī)院病理科使用，能顯著提高腎活檢病理診斷的準確性。

在上述套染的實際操作過程中，作者有以下幾點體會：(1)穿刺組織固定必須充分，固定液使用10%中性緩沖福爾馬林為宜；(2)免疫組化抗原修復方法很多，但微波修復+胰蛋白酶消化為抗原修復的最佳方法；(3)PAS染色液及0.5%過碘酸需新鮮配制；(4)蘇木精染色前應將切片酸化，用2 mol/L H2SO4酸化2 min，效果比使用同樣濃度的鹽酸更佳，蘇木精染色時間需適當延長。

總之，本實驗采用免疫組化+PAS套染法雖然步驟較多，但內容簡單，便于操作，染色結果清晰，便于推廣應用。