外周血細(xì)胞FISH快速檢測反應(yīng)體系的分析

劉玲玲，李貴喜，李三華，張紹敏，劉文弟，齊 華

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是一種通過帶有熒光標(biāo)記的核苷酸片段，經(jīng)過變性、復(fù)性結(jié)合到目的基因片段上，用以獲得目的基因信息狀態(tài)的技術(shù)。自20世紀(jì)80年代中后期建立以來[1]，該技術(shù)得到了飛速發(fā)展，架起了細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的橋梁，在血液病、產(chǎn)前診斷和乳腺癌、膀胱癌、子宮頸癌等實(shí)體腫瘤的臨床診斷和治療監(jiān)測中發(fā)揮重要作用[2]。盡管相對(duì)于其他診斷方法，F(xiàn)ISH具有諸多優(yōu)勢如：熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全，探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在2年內(nèi)使用且實(shí)驗(yàn)周期短、迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確，但是傳統(tǒng)FISH仍需要過夜雜交(>16 h)以促使熒光信號(hào)能夠達(dá)到判讀標(biāo)準(zhǔn)[3-6]。

目前，用于檢測血液病染色體異常的FISH仍然以傳統(tǒng)過夜雜交體系為主，不能滿足外周血細(xì)胞的快速診斷需求。因此，本科室對(duì)適用于快速檢測外周血細(xì)胞的FISH體系進(jìn)行分析，取得良好效果現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 人外周血細(xì)胞樣本由河南賽諾特生物公司醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所提供。

1.1.2試劑 甲酰胺(2665C106，AMRESCO公司)；硫酸葡聚糖(109A036，Solarbio公司)；NaCl(20170824，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)；丙三醇(20170113，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)；SDS(BB05BA0026，BBI公司)；Cot-1 DNA(15279-101，Invitrogen公司)；碳酸乙烯酯(E26258，Sigma公司)；DAPI(20140725，Solarbio公司)。FISH探針：CEP 7/7q探針由河南賽諾特生物公司提供。

1.1.3儀器 雜交儀(CNT200，深圳賽諾特生物公司)；恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠)；熒光顯微鏡(寧波舜宇公司)。

1.2 方法

1.2.1探針制備 (1)雜交緩沖液配制：緩沖液F(20%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，0.9%NaCl)；緩沖液G(20%丙三醇，10%硫酸葡聚糖，0.9%NaCl)；50%甲酰胺緩沖液(50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，0.1%SDS，2×SSC)；碳酸乙烯酯緩沖液(20%硫酸葡聚糖，15%碳酸乙烯酯，600 mmol/L NaCl，10 mmol/L檸檬酸，pH 6.2)。(2)雜交探針配制：將紅色探針、綠色探針、Cot-1 DNA和雜交緩沖液按1 ∶1 ∶1 ∶7的比例配制后混勻離心備用。

1.2.2外周血細(xì)胞樣本制備 (1)將2～3 mL外周血(肝素鈉抗凝)細(xì)胞樣本放置于離心機(jī)中2 000 r/min離心5 min，棄上清；(2)向細(xì)胞懸液中加入10 mL的低滲緩沖液輕柔吹打混勻，靜置2 min，37 ℃恒溫水浴15～20 min，然后加入固定液(冰乙酸 ∶甲醇為1 ∶3，現(xiàn)配現(xiàn)用)1 mL輕柔吹打混勻，室溫預(yù)固定10 min；(3)離心5 min，棄上清，加入5 mL固定液，吹打混勻，-20 ℃沉淀30 min以上；(4)樣本于-20 ℃儲(chǔ)存，10天內(nèi)使用完畢。制片(細(xì)胞滴片)：取制備好的10 μL細(xì)胞樣本懸液滴加-20 ℃預(yù)冷的載玻片，室溫晾干，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度，并用新鮮配制固定液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，要求單視野細(xì)胞數(shù)量在100～200個(gè)為宜。

1.2.3FISH實(shí)驗(yàn) 將制備完成的細(xì)胞片于60 ℃烤20～30 min，2×SSC中浸泡5 min，然后向雜交區(qū)域加入10 μL配好的探針，加蓋玻片(20 mm×20 mm)，封片膠封固。于雜交儀上進(jìn)行變性和雜交。雜交完成后去除封片膠并移去蓋玻片，于73 ℃預(yù)熱的0.3%NP 40/1×SSC溶液中孵育2 min，室溫0.1%NP40/2×SSC中處理2 min，使用75%、85%、95%乙醇各依次處理1 min后室溫晾干，加10 μL 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染液，室溫10 min后鏡下觀察分析結(jié)果。

1.2.4熒光顯微鏡圖像分析 用熒光顯微鏡在DAPI視野下定位，并采用激發(fā)波長為496 nm、發(fā)散波長為520 nm觀察，并采集綠色熒光信號(hào)；采用激發(fā)波長為551 nm、發(fā)散波長為572 nm觀察，并采集紅色熒光信號(hào)；最后DAPI、綠色熒光信號(hào)、紅色熒光信號(hào)圖像疊加合并成組合圖像。通過AxioVisionRel 4.8軟件分析圖像，評(píng)估探針雜交情況。

2 結(jié)果

2.1 雜交緩沖液對(duì)外周血細(xì)胞樣本快速雜交FISH的影響分別使用緩沖液F、緩沖液G、50%甲酰胺緩沖液、碳酸乙烯酯緩沖液和FISH探針CEP 7/7q配制成工作液。采用血液細(xì)胞滴片，通過雜交儀95 ℃變性2 min，55 ℃雜交3 h進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)顯示：在相同雜交時(shí)間下，碳酸乙烯酯緩沖液FISH探針信號(hào)清晰明亮，能夠輕松判讀結(jié)果；緩沖液F和緩沖液G的FISH探針紅色和綠色信號(hào)亮度均較弱；雖然50%甲酰胺緩沖液FISH探針紅色信號(hào)亮度稍強(qiáng)，但綠色信號(hào)亮度較弱；緩沖液F、緩沖液G和50%甲酰胺緩沖液FISH探針信號(hào)亮度，均不能滿足結(jié)果判讀的要求(圖1)。因此，與其他雜交緩沖液相比，碳酸乙烯酯緩沖液效果更佳。

圖1 不同雜交緩沖液FISH檢測：A.緩沖液F；B.緩沖液G；C.50%甲酰胺緩沖液；D.碳酸乙烯酯緩沖液

2.2 雜交溫度對(duì)外周血細(xì)胞樣本快速雜交FISH的影響本實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置不同雜交溫度(50、53、55、57和60 ℃)進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)分析最佳雜交溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在相同雜交時(shí)間下，雜交溫度為55 ℃時(shí)，F(xiàn)ISH探針紅色和綠色信號(hào)亮度最強(qiáng)。雜交溫度從50～55 ℃時(shí)，F(xiàn)ISH探針紅色和綠色信號(hào)亮度逐漸增強(qiáng)；雜交溫度從55～60 ℃時(shí)，F(xiàn)ISH探針紅色和綠色信號(hào)亮度依次減弱(圖2)。因此，55 ℃是外周血細(xì)胞樣本最佳快速雜交溫度。

2.3 雜交時(shí)間對(duì)外周血細(xì)胞樣本快速雜交FISH的影響為了確定外周血細(xì)胞樣本FISH快速雜交的最佳時(shí)間，作者采用碳酸乙烯酯緩沖液、CEP 7/7q探針，在55 ℃條件下分別設(shè)置1、2、3和4 h的雜交時(shí)間進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：在相同雜交溫度條件下，雜交3 h的FISH探針紅色和綠色信號(hào)亮度最強(qiáng)。當(dāng)雜交1、2和3 h的FISH探針紅色和綠色信號(hào)亮度逐漸增強(qiáng)，但當(dāng)雜交時(shí)間繼續(xù)延長為4 h后FISH探針紅色和綠色信號(hào)亮度出現(xiàn)降低(圖3)。因此，外周血細(xì)胞樣本FISH快速雜交的最佳時(shí)間為3 h。

②A②B②C②D②E③A③B③C③D圖2 不同雜交溫度FISH檢測:CEP7/7q探針經(jīng)95℃變性2min后,分別經(jīng)50℃(A)、53℃(B)、55℃(C)、57℃(D)、60℃(E)雜交3h 圖3 不同雜交時(shí)間FISH檢測:CEP7/7q探針經(jīng)95℃變性2min后,55℃分別雜交1h(A)、2h(B)、3h(C)、4h(D)

2.4 變性溫度對(duì)血液細(xì)胞樣本快速雜交FISH的影響FISH實(shí)驗(yàn)通常需要對(duì)目的DNA和探針進(jìn)行變性處理，以促進(jìn)雜交過程的進(jìn)行。為了探究變性溫度是否會(huì)對(duì)雜交結(jié)果產(chǎn)生影響和確立最佳變性溫度，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置80、85、90和95 ℃為變性溫度進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在雜交溫度和時(shí)間相同條件下，90 ℃變性2 min的FISH探針信號(hào)亮度和特異性最佳。變性溫度分別為80、85和90 ℃時(shí)FISH探針信號(hào)亮度依次增強(qiáng)(綠色信號(hào)尤為明顯)，變性溫度為95 ℃時(shí)FISH探針信號(hào)特異性降低(圖4)。因此，變性溫度過高或過低均能影響FISH探針信號(hào)的亮度和特異性，碳酸乙烯酯緩沖液條件下外周血細(xì)胞樣本的最佳變性溫度為90 ℃。

圖4 不同變性溫度FISH檢測：CEP 7/7q探針分別經(jīng)80 ℃(A)、85 ℃(B)、90 ℃(C)和95 ℃(D)變性2 min后，經(jīng)55 ℃雜交3 h

3 討論

染色體異常包括染色體擴(kuò)增、缺失、重排等是引起血液病的重要發(fā)病機(jī)制。FISH通過帶有熒光標(biāo)記的核苷酸片段，能夠監(jiān)測細(xì)胞染色體和基因組，從而獲得目的基因的信息狀態(tài)，因此已成為血液病精準(zhǔn)診斷和微小殘留監(jiān)測及預(yù)后評(píng)估不可或缺的工具。目前，國內(nèi)無論是外周血細(xì)胞樣本還是石蠟包埋組織樣本，為促進(jìn)探針和目的核酸分子的充分雜交，達(dá)到富集探針信號(hào)的目的，F(xiàn)ISH診斷的實(shí)驗(yàn)體系仍為過夜雜交的傳統(tǒng)FISH操作流程。對(duì)于外周血細(xì)胞樣本，前期樣本處理簡單迅速，無需石蠟包埋、切片及長時(shí)間烤片等繁雜的處理過程，而傳統(tǒng)過夜雜交FISH實(shí)驗(yàn)體系耗時(shí)久，效率低下，不能滿足當(dāng)天出具檢驗(yàn)報(bào)告的要求，是限制對(duì)外周血細(xì)胞染色體異常情況做出快速診斷的主要步驟。因此，有必要探討適用于快速檢測外周血染色體異常的FISH體系，以滿足國內(nèi)臨床診斷需求。

在核酸分子雜交過程中，通常SSC充當(dāng)維持鹽離子平衡的角色，不同濃度的甲酰胺(或其他化合物如碳酸乙烯酯)能夠降低探針Tm值，硫酸葡聚糖能夠促進(jìn)分子雜交。若甲酰胺濃度較低則探針Tm值較高，難以實(shí)現(xiàn)核酸分子有效雜交，如緩沖液F；若硫酸葡聚糖濃度較低則核酸分子雜交效率低下，如50%甲酰胺緩沖液和緩沖液F；然而，碳酸乙烯酯緩沖液具有相對(duì)較高的硫酸葡聚糖和較適合的Tm值促進(jìn)分子雜交。采用碳酸乙烯酯緩沖液分別設(shè)置不同變性、雜交溫度和雜交時(shí)間，以確定最佳變性溫度、雜交溫度和雜交時(shí)間。本組結(jié)果顯示變性溫度≥90 ℃探針信號(hào)亮度進(jìn)入平臺(tái)期；雜交溫度為55 ℃時(shí)探針信號(hào)亮度達(dá)到頂峰，>55 ℃或<55 ℃時(shí)探針信號(hào)亮度均降低；雜交時(shí)間為3 h時(shí)探針信號(hào)亮度達(dá)到頂峰，>3 h時(shí)探針信號(hào)亮度反而降低，推測可能與雜交緩沖液特性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)FISH快速檢測體系適用性強(qiáng)，效率高，可用于替代傳統(tǒng)FISH檢測用于臨床診斷，縮短檢測周期。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，變性溫度>90 ℃時(shí)雖然FISH探針信號(hào)亮度未受太大影響，但探針信號(hào)特異性出現(xiàn)降低，提示在外周血細(xì)胞樣本FISH快速檢測實(shí)驗(yàn)時(shí)不宜采用過高的變性溫度。