黏液黏蛋白的藥動學(xué)研究進展

劉韋鋆， 崔云峰

黏液是黏膜表面的黏彈性保護層，由一些特殊的上皮細胞合成，如杯狀細胞。黏液分布在身體所有暴露在外部環(huán)境下的器官，如眼睛、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和陰道等（圖1）[1-2]，但其特性（組成、結(jié)構(gòu)、厚度）不盡相同，如在小腸中僅有一個疏松單層，而在大腸中卻是兩層結(jié)構(gòu)（疏松的外層和致密的內(nèi)層）（圖2）[3]。

圖2 小腸和大腸中的黏液

1 黏液的生理功能

黏液的結(jié)構(gòu)不同，有疏松層和致密層的區(qū)別。疏松層呈現(xiàn)單分子狀態(tài)，致密層呈現(xiàn)聚合物狀態(tài)。由此決定著黏液的功能也有差別。致密層黏液被認為是阻止病原體、有害物質(zhì)接觸底層組織的天然屏障。細菌的脂多糖和肽聚糖刺激黏膜，促使黏液分泌增加。其與病原體的作用方式有：黏液網(wǎng)絡(luò)的誘捕，黏液結(jié)構(gòu)的疏水，黏液聚糖的結(jié)合，黏液的空間阻隔，黏液流動和更新的清除。此外，潘氏細胞和腸上皮細胞分泌抗菌肽、溶菌酶、分泌型免疫球蛋白（SIgA）到黏液層[4]，黏液可為其提供結(jié)合位點，將其逐漸濃集在上皮表面，減慢其稀釋和排入腸腔的速度（抗菌作用從上皮細胞到腸腔呈梯度下降）[5]，輔助發(fā)揮腸屏障作用。同時，黏液也會阻隔藥物的跨膜擴散過程或黏附藥物[6-10]。而益生菌則可以利用疏松層黏液作為它們優(yōu)選的定植部位，利用黏蛋白高數(shù)量的寡聚糖鏈結(jié)構(gòu)作為附著點。黏液為益生菌的新陳代謝提供能量。其次，黏液還有許多生理功能：潤滑腔道，維持上皮細胞上水分層，作為交換氣體和營養(yǎng)物質(zhì)的可滲透凝膠層和轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞信號等。

2 黏液的組成

黏液含有90%～95%的水、2%～5%的糖蛋白、脂質(zhì)（如脂肪酸、磷脂和膽固醇等）、蛋白質(zhì)（如溶菌酶、免疫球蛋白、防御素和生長因子等）、電解質(zhì)、生長因子和DNA等，但主要成分是一種糖蛋白，稱作黏蛋白。它是黏液的框架，反映黏液的特征。

3 黏蛋白的分子結(jié)構(gòu)

黏蛋白是一類高分子量（200 kDa～200 mDa）和大量糖基化（高達80%）的蛋白質(zhì)。其分子由蛋白質(zhì)核心和糖基組成。蛋白質(zhì)核心稱作“apo黏蛋白”，有兩個區(qū)域，一個是中央糖基化區(qū)域，由大量富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的串聯(lián)重復(fù)序列組成；另一個是以球狀蛋白為代表的氨基酸區(qū)域（非糖基化區(qū)域），位于氨基和羧基末端，有時穿插在STP重復(fù)之間。糖基存在于蛋白質(zhì)核心周圍，由大量的碳水化合物（N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、巖藻糖、半乳糖、N-乙酰神經(jīng)氨酸）和少量的甘露糖、硫酸鹽組成。以O(shè)-低聚糖和N-聚糖鏈結(jié)合于蛋白質(zhì)核心（圖3）[11]。

圖3 黏蛋白分子結(jié)構(gòu)

4 黏蛋白的基因亞型及分類

將近二十多種黏蛋白基因亞型已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在于人體。在大鼠和小鼠中也存在部分同源染色體[12]。黏蛋白的基因亞型包括：MUC1、MUC2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、MUC19、MUC20等。這些基因亞型分為兩類：分泌型黏蛋白和膜結(jié)合型黏蛋白（圖4）[13]。分泌型黏蛋白可形成巨大聚合物網(wǎng)絡(luò)，表達于整個腔道；膜結(jié)合型黏蛋白結(jié)合于上皮細胞膜表面，是分泌型網(wǎng)絡(luò)的錨[14]，有黏附、信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、修復(fù)上皮和愈合黏膜等作用[15]。大多數(shù)黏蛋白基因家族定位于染色體7q22和11p15.5[16-17]。一些小的膜結(jié)合型黏蛋白并不被看作是真正的黏蛋白，它們與其他黏蛋白共享某些區(qū)域[18]。不同種屬間同種黏蛋白基因亞型高度相似[12]。不同部位所包含的基因亞型不同，如小腸主要表達MUC2[19-20]，膽囊主要表達MUC5B[21]。

圖4 黏蛋白分類

5 黏蛋白的理化特性

黏蛋白作為一種聚合物，呈現(xiàn)兩種構(gòu)象，等向折疊的無規(guī)則螺旋狀和非等向延伸的無規(guī)則螺旋狀。糖基是維持延伸構(gòu)象的關(guān)鍵[22]。黏蛋白構(gòu)象同樣取決于pH值和離子強度，而不是鹽濃度和溫度。低pH值中呈現(xiàn)延伸構(gòu)象，高pH值中呈現(xiàn)折疊構(gòu)象[23]。黏蛋白之間可以相互作用，也可以與黏液的其他成分相互作用[24]。在一定條件下，黏蛋白有聚集和成膠的潛在趨勢。隨著pH值的減少，黏蛋白相互聚集，逐漸成膠，黏度與濁度增大，發(fā)生單分子-聚合物的分子狀態(tài)變化[22,25]。其分子機制可能是當(dāng)帶負電荷的羧酸鹽在低pH值的情況下被質(zhì)子化時，鹽橋（由帶負電的羧酸鹽和帶正電的氨基酸側(cè)鏈組成）的破壞導(dǎo)致黏蛋白纖維的聚集[26-27]。此外，隨黏液與上皮細胞距離的變化和腸道細菌的影響，黏蛋白的分子狀態(tài)也發(fā)生變化[28-29]。黏蛋白與脂質(zhì)存在靜電、疏水、氫鍵的相互作用[30]，易于吸附疏水物質(zhì)表面[31]。

6 黏蛋白變化的誘因

黏蛋白狀態(tài)的改變，尤其是糖基化模式和表達水平的改變，可引起黏蛋白數(shù)量、結(jié)構(gòu)、功能或分泌的異?；?。這和特殊的生理變化或疾病相關(guān)。在感染、炎癥、囊性纖維化、支氣管炎、哮喘、膽結(jié)石和癌癥中，黏蛋白表達過度[32-37]。在干眼綜合征和潰瘍中，黏蛋白表達不足[38-39]。這些可以被看作病理學(xué)標志物。年齡和飲食也可以改變黏液的厚度和組成[40-43]。小兒和老人的黏液層薄于成人，黏蛋白合成和分泌少。食物因素（如纖維素、蛋白、抗營養(yǎng)因子等）會影響來自杯狀細胞的黏蛋白合成和分泌。在以上變化中，黏蛋白的特性和功能取決于離子強度，pH值起重要作用[26]。

7 黏蛋白研究的藥動學(xué)實驗?zāi)Ｐ?/h2>

近些年來，黏蛋白的藥動學(xué)行為研究越來越受到重視，如黏蛋白對藥物及其制劑的吸收屏障作用，黏蛋白對藥物的溶出穩(wěn)定作用，黏蛋白對內(nèi)源性物質(zhì)的成核作用等。隨著研究的深入，相關(guān)的實驗?zāi)Ｐ鸵仓饾u成熟起來。

7.1 黏蛋白實驗?zāi)Ｐ吞烊火ひ嚎梢詮慕M織表面收集，直接用于研究，如屏障實驗[44-52]；穩(wěn)定性或成核實驗[53-57]。雖然天然黏液反映了真實的體內(nèi)黏液組成和結(jié)構(gòu)，但是由于組成復(fù)雜、不確定、高變異性不能解釋特定黏蛋白的具體機制[6]。純化黏蛋白的成分相對確定，可以清楚地解釋分子機制。同時，也可以根據(jù)目的考察幾種特定黏蛋白成分的相互作用。純化黏蛋白大多是商品化的，批次之間差異不大[58-61]。

7.2 細胞實驗?zāi)Ｐ腕w內(nèi)黏液的性質(zhì)會隨與其下上皮細胞距離的變化而變化[28-29]。一些體外培養(yǎng)細胞系可分泌特定黏蛋白，并具有這種性質(zhì)。他們可應(yīng)用于不同轉(zhuǎn)運實驗裝置，如Transwell, Ussing Chamber等（圖5）[6]。細胞模型也用于藥物調(diào)控黏蛋白分泌的研究。同樣，也可將制備的黏蛋白加于無黏蛋白分泌的細胞系，進行相關(guān)細胞實驗[62]。此外，應(yīng)用多器官細胞混合培養(yǎng)模型研究不同器官黏膜組織的對話[63-64]。

圖5 細胞的轉(zhuǎn)運模型

7.3 組織和動物實驗?zāi)Ｐ腕w內(nèi)有更復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境，影響?zhàn)さ鞍椎姆肿訝顟B(tài)；體內(nèi)有吸收過程，藥物不斷從腸液移除進入血流，體現(xiàn)動力學(xué)特征。因此，體外實驗不能完全證明。離體組織模型、在體模型和動物模型可以真實地反映體內(nèi)不同部位天然黏膜環(huán)境的特征，如組成、結(jié)構(gòu)、厚度，動力學(xué)。離體組織模型是體內(nèi)環(huán)境的快照，包括離體腸片、離體腸環(huán)、外翻腸囊、Ussing Chamber[65-66]；在體模型保持動物完整的血循環(huán)、神經(jīng)系統(tǒng)和代謝功能，包括腸灌流和閉合腸環(huán)[67-68]；動物模型有利于體現(xiàn)各種因素引起的黏液層改變，包括無菌動物模型，基因敲除動物模型，特殊疾病動物模型[69-73]。

8 展望

當(dāng)前本實驗室正在研究黏蛋白對不同結(jié)晶行為難溶性藥物過飽和溶液穩(wěn)定性的影響及其機制。該研究可以進一步增進我們關(guān)于黏蛋白的認識；提示在生理或病理狀態(tài)下黏蛋白對過飽和的作用；改進藥物傳遞系統(tǒng)，增強難溶性藥物的吸收和生物利用度；啟發(fā)一些關(guān)于控制黏蛋白以增強胃腸道功能的手段。黏蛋白的新功能尚待研究者進一步去發(fā)現(xiàn)。