低溫對(duì)南極假山毛櫸光系統(tǒng)Ⅱ的影響

翟 瑜，周 帥，郝向春，韓麗君

（山西省林業(yè)科學(xué)研究院，山西 太原 030012）

光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)是植物對(duì)溫度脅迫最敏感的光合系統(tǒng)組分[1-3]，利用非損傷、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)技術(shù)[4-5]，可以方便地研究溫度與PSⅡ光化學(xué)活性之間的關(guān)系。低溫脅迫會(huì)引起快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP曲線)趨向平緩、O相升高、J相下降或上升、I相和P相下降、K 點(diǎn)和L點(diǎn)出現(xiàn)[6-8]等變化，反映出PSⅡ有活性的反應(yīng)中心數(shù)量減少[9]，反應(yīng)中心吸收和熱耗散的能量增加[9-11]，以及PSⅡ受體側(cè)的電子傳遞速率降低等光合作用的“內(nèi)在變化”[11-12]。低溫脅迫還會(huì)使葉片葉綠素降解[12-13]，導(dǎo)致光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生改變。目前多數(shù)研究采用離體試驗(yàn)材料、野外觀測(cè)、設(shè)置單一溫度處理等方式，溫度與PSⅡ光化學(xué)活性的關(guān)系難以被準(zhǔn)確描述。為獲得不同脅迫程度下葉綠素?zé)晒獾木C合性指標(biāo)，當(dāng)前研究主要利用隸屬函數(shù)法[14-15]、主成分分析法[16-17]、TOPSIS綜合評(píng)價(jià)法[18-19]和綜合生物反應(yīng)指數(shù)(integrated biomarker response，IBR)[20]計(jì)算綜合指標(biāo)。其中IBR評(píng)價(jià)法具有操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)和應(yīng)用廣泛的特點(diǎn)，但尚未用于計(jì)算低溫脅迫下的葉綠素?zé)晒饩C合指標(biāo)。南極假山毛櫸Nothofagus antarctica為殼斗科Fagaceae假山毛櫸屬Nothofagus落葉喬木或灌木，主要分布在南美洲南部的溫帶森林，耐寒能力極強(qiáng)[21]，為探索低溫環(huán)境下南極假山毛櫸光合生理特性，本研究采用連續(xù)測(cè)定與控制試驗(yàn)的方法，觀測(cè)低溫脅迫下南極假山毛櫸葉片相對(duì)葉綠素含量(relative chlorophyll content)、OJIP曲線特征、快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)測(cè)量(JIP-test)參數(shù)等的變化，并將JIP-test參數(shù)代入IBR評(píng)價(jià)法，用以闡明低溫脅迫對(duì)南極假山毛櫸PSⅡ光化學(xué)活性的影響規(guī)律，并檢驗(yàn)IBR評(píng)價(jià)法用于計(jì)算低溫脅迫下的葉綠素?zé)晒饩C合指標(biāo)的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理方法

供試材料為2年生南極假山毛櫸實(shí)生苗(山西省林業(yè)科學(xué)研究院基地培育)，株高(50±5) cm。2018年9月初，選取長(zhǎng)勢(shì)良好，無(wú)病蟲害，大小相近的南極假山毛櫸5盆，置于人工氣候箱中適應(yīng)培養(yǎng)3 d。人工氣候箱參數(shù)為：溫度25 ℃；晝夜相隔時(shí)間12 h；光照強(qiáng)度500 μmol·m-2·s-1；相對(duì)濕度(60±3)%，根據(jù)表土干燥情況適量澆水。設(shè)置25、15、5、-5、-15和-25 ℃等6個(gè)測(cè)試溫度，從25 ℃依次降低，降溫速率為2 ℃·h-1，待植株在5 ℃的人工氣候箱中測(cè)試完畢，轉(zhuǎn)移到3 ℃預(yù)冷的冰柜中，繼續(xù)以2 ℃·h-1的速率依次降到-5、-15和-25 ℃；各溫度下處理時(shí)間為24 h。冰柜裝有人工光源，光照強(qiáng)度500 μmol·m-2·s-1，采用大氣采樣儀(QC-1S，北京市科安勞保新技術(shù)公司)從冰柜門縫隙處向內(nèi)緩慢送氣。

各測(cè)試溫度下處理完成后，在原處理環(huán)境下關(guān)閉光源，使植株暗適應(yīng)20 min；立刻進(jìn)行快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)測(cè)量，隨后立即測(cè)定相對(duì)葉綠素含量。同1株上的2項(xiàng)測(cè)量均在同1片健康、成熟的葉片上進(jìn)行，測(cè)量位置相互錯(cuò)開。每個(gè)處理5盆，每盆作為1個(gè)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定5片·盆-1。以25 ℃處理為對(duì)照(ck)。10:00測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 相對(duì)葉綠素含量測(cè)定 采用葉綠素測(cè)定儀(SPAD-502Plus，KONICA MINOLTA，日本)測(cè)定各溫度處理下植株的相對(duì)葉綠素含量(SPAD值)。

1.2.2 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)測(cè)量(JIP-test) 采用葉綠素?zé)晒鈨x(Yaxin-116G，雅欣理儀公司)測(cè)定快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP)，測(cè)定前暗適應(yīng)20 min，選取葉肉部分用3 000 μmol·m-2·s-1飽和藍(lán)閃光照射1 s，以10 μs (300 μs之前)、100 μs (300 μs～3 ms)和1 ms (3 ms之后)的間隔記錄熒光信號(hào)，并計(jì)算葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 OJIP曲線處理 葉片經(jīng)過暗適應(yīng)后再給予飽和藍(lán)閃光照射，散發(fā)的熒光隨時(shí)間變化的曲線，構(gòu)成葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線。暗適應(yīng)后出現(xiàn)最小熒光O相，此時(shí)PSⅡ處于“完全開放”狀態(tài)；照射強(qiáng)光后，陸續(xù)出現(xiàn)J、I相，最終由于PSⅡ反應(yīng)中心關(guān)閉，達(dá)到P相。將不同溫度處理的OJIP曲線離差標(biāo)準(zhǔn)化。應(yīng)用公式VO-P＝(Ft-FO)/(FP-FO)計(jì)算FO與FP間相對(duì)可變熒光強(qiáng)度(VO-P)，其中Ft表示t時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)O表示暗適應(yīng)后的最小熒光強(qiáng)度，F(xiàn)P表示暗適應(yīng)后的最大熒光強(qiáng)度。應(yīng)用公式△VO-P＝VO-P(處理)-VO-P(ck)計(jì)算FO與FP間相對(duì)可變熒光強(qiáng)度差值(△VO-P)。FO與FJ、FK間的相對(duì)可變熒光強(qiáng)度差值(△VO-J和△VO-K)的計(jì)算方式同VO-P和△VO-P。

1.3.2 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線參數(shù)計(jì)算 暗適應(yīng)后照光，O、L、K、J、I、P點(diǎn)分別表示最小熒光、0.15 ms熒光，0.30 ms熒光，2.00 ms熒光、30.00 ms熒光和最大熒光[22]，其中0.15和0.30 ms時(shí)的相對(duì)熒光強(qiáng)度用VL和VK表示，PSⅡ單位面積反應(yīng)中心數(shù)量(RC/CSO)、單位反應(yīng)中心吸收的能量(ABS/RC)、單位反應(yīng)中心以熱能形式耗散的能量(DIO/RC)、單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原初級(jí)醌受體(QA)的能量(TRO/RC)、單位反應(yīng)中心用于將電子從QA-傳遞到質(zhì)體醌(PQ)的能量(ETO/RC)、單位反應(yīng)中心用于將電子從QA-傳遞到光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)的能量(REO/RC)、PSⅡ光化學(xué)初級(jí)最大效率(φPO，意義與暗適應(yīng)下PSⅡ的最大量子產(chǎn)額Fv/Fm相同)、PSⅡ捕獲的電子從QA-傳遞到PQ的效率(ψEO)、電子從PQH2傳遞到PSⅠ最終受體側(cè)的效率(δRO)、葉片性能指數(shù)(PIABS)等參數(shù)計(jì)算參照文獻(xiàn)[22]和[23]。

1.3.3 綜合生物反應(yīng)指數(shù)(IBR)計(jì)算 計(jì)算方法參照文獻(xiàn)并略有改動(dòng)：①計(jì)算各項(xiàng)熒光參數(shù)在所有處理下的平均值m和標(biāo)準(zhǔn)差s；②代入公式(1)對(duì)各處理下的各項(xiàng)熒光參數(shù)(X)標(biāo)準(zhǔn)化，得到Y(jié)；③對(duì)不同溫度處理下的各項(xiàng)熒光參數(shù)進(jìn)行回歸擬合，如果某項(xiàng)熒光參數(shù)的擬合曲線隨著溫度降低而上升，則Z＝Y(jié)，反之則Z＝-Y；④依據(jù)公式(2)計(jì)算不同溫度處理下單項(xiàng)熒光參數(shù)的得分Si，其中|Zmin|是某溫度處理下所有熒光參數(shù)Z值的最小值的絕對(duì)值；⑤以某溫度處理下某項(xiàng)熒光參數(shù)的Si值作為輻射線的長(zhǎng)度繪制星狀圖，各溫度處理下的綜合生物反應(yīng)指數(shù)(IBR)由順時(shí)針相鄰熒光參數(shù)的輻射線圍成的三角形面積Ai之和得到公式(3)，公式(3)中的Ai依據(jù)公式(4)計(jì)算，公式(4)中的n為參與計(jì)算的熒光參數(shù)的個(gè)數(shù)。

1.3.4 相關(guān)性分析和多重比較 將各處理所得的IBR、Fv/Fm、PIABS、相對(duì)葉綠素含量進(jìn)行相關(guān)性分析，依據(jù)Pearson參數(shù)和顯著性，檢驗(yàn)IBR評(píng)價(jià)法用于計(jì)算低溫脅迫下的葉綠素?zé)晒饩C合指標(biāo)的可行性。采用SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用最小顯著差法(LSD)進(jìn)行多重比較，采用Origin 2018進(jìn)行回歸分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)相對(duì)葉綠素含量的影響

由圖1可知：15和5 ℃時(shí)相對(duì)葉綠素含量無(wú)顯著變化，-5 ℃時(shí)開始顯著下降，-25 ℃時(shí)極顯著降低，與對(duì)照相比降低了63.8%。表明≤-5 ℃的低溫環(huán)境會(huì)導(dǎo)致南極假山毛櫸葉片相對(duì)葉綠素含量顯著降低。

2.2 溫度對(duì)快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線的影響

由圖2可知：5、15和25 ℃處理下OJIP曲線出現(xiàn)O、J、I、P各相(圖2A、B)，表明這些溫度下電子傳遞鏈運(yùn)轉(zhuǎn)正常；-5、-15和-25 ℃的OJIP曲線較為平緩(圖2A)，缺少J相和I相(圖2B)。將標(biāo)準(zhǔn)化的各處理曲線與ck相減，可見J相和I相合并，并且在光照極短時(shí)間(約0.03 ms)出現(xiàn)1個(gè)較大峰(圖2C)，表明電子傳遞鏈嚴(yán)重受阻。OJIP曲線在5 ℃出現(xiàn)典型的K點(diǎn)(圖2D)和L點(diǎn)(圖2E)，表明PSⅡ供體側(cè)和PSⅡ反應(yīng)中心受損。

圖1 溫度變化對(duì)相對(duì)葉綠素含量的影響Figure 1 SPAD value of leaves under different temperature treatments

圖2 溫度變化對(duì)葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線的影響Figure 2 Chlorophyll fluorescence kinetics curve of leaves under different temperature treatments

2.3 溫度對(duì)快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線參數(shù)的影響

2.3.1 對(duì)PSⅡ供體的影響 由圖3A可知：VK隨著溫度降低，-5、-15和-25 ℃時(shí)均與對(duì)照達(dá)到顯著差異，表明≤-5 ℃的低溫處理會(huì)造成PSⅡ供體側(cè)損傷。

2.3.2 對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心的影響-5、-15、-25 ℃處理下VL上升明顯(圖3B)，表明≤-5 ℃的低溫導(dǎo)致PSⅡ各單位之間的能量流通不暢。從-5 ℃到-25 ℃，RC/CSO隨著溫度降低逐漸減少(圖3C)，但-15 ℃的RC/CSO顯著高于-5 ℃，表明-15 ℃時(shí)PSⅡ單位面積反應(yīng)中心數(shù)量出現(xiàn)短暫回升。從-5 ℃開始，隨著溫度降低，ABS/RC(圖3D)、TRO/RC(圖3E)和DIO/RC(圖3F)持續(xù)增加，-25 ℃時(shí)分別比對(duì)照增加331.0%、134.7%和1 112.7%，表明由于缺少可供還原的QA，PSⅡ單位反應(yīng)中心集聚了大量能量。

2.3.3 對(duì)PSⅡ受體側(cè)的影響 與對(duì)照相比，ETO/RC(圖3G)和REO/RC(圖3H)在-15和15 ℃時(shí)短暫下降，REO/RC在-25 ℃時(shí)又顯著下降，表明高于-15 ℃的溫度對(duì)PSⅡ受體側(cè)的能量傳輸影響較小。當(dāng)溫度從25 ℃降低到5 ℃時(shí)，φPO(圖3I)和ψEO(圖3J)與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，δRO(圖3K)僅在15 ℃時(shí)出現(xiàn)短暫下降；當(dāng)溫度繼續(xù)降低到-5 ℃時(shí)，3項(xiàng)參數(shù)均顯著下降，表明≤-5 ℃的低溫對(duì)PSⅡ的電子傳遞效率有顯著負(fù)面影響。

2.3.4 對(duì)Fv/Fm和PIABS的影響 隨著溫度降低，F(xiàn)v/Fm與φPO的變化趨勢(shì)相同(圖4)。5 ℃時(shí)，PIABS顯著低于對(duì)照，-5、-15和-25 ℃時(shí)，PIABS接近于0，表明≥15 ℃的環(huán)境溫度對(duì)南極假山毛櫸葉片的光能吸收無(wú)顯著影響，≤5 ℃時(shí)開始出現(xiàn)低溫脅迫，≤-5 ℃會(huì)造成嚴(yán)重的冰凍脅迫(圖5)。

圖3 溫度變化對(duì)南極假山毛櫸快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線參數(shù)的影響Figure 3 Parameters of chlorophyll a fluorescence transient under different temperature treatments

圖4 溫度變化對(duì)Fv/Fm的影響Figure 4 Fv/Fm of leaves under different temperature treatments

圖5 溫度變化對(duì)葉片性能指數(shù)的影響Figure 5 PIABS of leaves under different temperature treatments

2.4 溫度對(duì)IBR的影響

隨著溫度從25 ℃降至-25 ℃，VK、VL、ABS/RC、DIO/RC、TRO/RC的擬合曲線持續(xù)上升，其余參數(shù)的擬合曲線持續(xù)下降(圖3)，因此對(duì)VL、VK、ABS/RC、DIO/RC、TRO/RC的標(biāo)準(zhǔn)后數(shù)值取正值，其余參數(shù)取負(fù)值，繪制星狀圖(圖6)并計(jì)算IBR(圖7)。與對(duì)照相比，IBR在5、-5和-15 ℃時(shí)顯著增加，-25 ℃極顯著升高。對(duì)IBR作回歸分析顯示：22 ℃為IBR拐點(diǎn)，高于或低于此溫度均導(dǎo)致IBR升高；表明IBR與溫度脅迫程度呈正相關(guān)，南極假山毛櫸葉片對(duì)光能的吸收利用效率最佳值在22 ℃，≤5 ℃的低溫會(huì)對(duì)南極假山毛櫸PSⅡ光化學(xué)活性造成脅迫。

圖6 不同溫度處理下綜合生物反應(yīng)指數(shù)星狀圖Figure 6 Star plots for biomarker responses under different temperature treatments

圖7 不同溫度處理下的綜合生物反應(yīng)指數(shù)Figure 7 IBR values under different temperature treatments

2.5 相關(guān)性分析

對(duì)各溫度處理下的Fv/Fm、PIABS、相對(duì)葉綠素含量、IBR和各測(cè)試溫度進(jìn)行相關(guān)性分析可見(表1)：IBR、相對(duì)葉綠素含量和溫度均為顯著負(fù)相關(guān)，表明IBR能較準(zhǔn)確反映溫度對(duì)南極假山毛櫸PSⅡ光化學(xué)活性以及對(duì)相對(duì)葉綠素含量的影響。Fv/Fm和PIABS雖然也與溫度呈顯著相關(guān)，但與相對(duì)葉綠素含量無(wú)顯著相關(guān)，表明IBR與相對(duì)葉綠素含量的相關(guān)度高于上述2項(xiàng)參數(shù)。

3 結(jié)論與討論

表1 Fv/Fm、IABS、相對(duì)葉綠素含量、IBR和溫度的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of Fv/Fm, PIABS, SPAD value, IBR and temperature

本研究中，當(dāng)溫度從25 ℃降低到15 ℃時(shí)，相對(duì)葉綠素含量、OJIP曲線、快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)測(cè)量參數(shù)和IBR沒有顯著變化，說(shuō)明15 ℃的環(huán)境溫度對(duì)南極假山毛櫸PSⅡ光化學(xué)活性的擾動(dòng)輕微。當(dāng)溫度降低到5 ℃時(shí)，OJIP曲線出現(xiàn)K點(diǎn)和L點(diǎn)，PIABS開始顯著下降，表明此階段的低溫主要對(duì)PSⅡ供體側(cè)和反應(yīng)中心構(gòu)成脅迫，即放氧復(fù)合體(OCE)出現(xiàn)損傷，PSⅡ各單位之間的能量流通不暢。從-5 ℃降至-25 ℃，相對(duì)葉綠素含量顯著降低，PSⅡ供體側(cè)受損加?。贿M(jìn)入電子傳遞鏈的電子減少，引起電子傳遞效率下降；光反應(yīng)的激發(fā)能不能及時(shí)傳遞到PSⅡ受體側(cè)而大量積累，最終造成PSⅡ各單位之間的能量流通混亂，部分能量只能以熱能的形式耗散。

OJIP曲線特征位點(diǎn)的變化能直觀地反映出PSⅡ反應(yīng)中心原初光化學(xué)反應(yīng)的變化。HU等[9]發(fā)現(xiàn)低溫處理下狗牙根Cynodon dactylon葉片OJIP曲線的相對(duì)熒光強(qiáng)度降低；曲麗娜等[7]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)低溫處理導(dǎo)致風(fēng)箱果Physocarpus amurensis葉片的OJIP 曲線趨于平緩、P相下降、K點(diǎn)和L點(diǎn)出現(xiàn)；劉倩倩等[6]也得出相似結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)低溫處理導(dǎo)致O相上升。本研究發(fā)現(xiàn)：隨著溫度降低，南極假山毛櫸葉片OJIP曲線的O相逐漸上升，-5、-15和-25 ℃的OJIP曲線趨于平滑，與前述研究結(jié)論相似；但前述物種均只涉及冷害脅迫(＞0 ℃)，而南極假山毛櫸經(jīng)歷凍害脅迫(＜0 ℃)才出現(xiàn)上述現(xiàn)象，這可能與其耐寒性強(qiáng)有關(guān)。-5、-15和-25 ℃處理時(shí)OJIP曲線在0.03 ms附近出現(xiàn)新拐點(diǎn)，可能因?yàn)楸鶅雒{迫導(dǎo)致PSⅡ反應(yīng)中心成為能量陷阱，能吸收光能但不能推動(dòng)電子傳遞[22]，大量能量的積聚造成的。

JIP-test分析以O(shè)JIP曲線為數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，可提供大量反映光合器官的結(jié)構(gòu)和功能的變化[23]。劉倩倩等[6]發(fā)現(xiàn)低溫脅迫導(dǎo)致PSⅡ供體側(cè)電子傳遞速率降低，PSⅡ反應(yīng)中心數(shù)量減少；曲麗娜等[7]研究表明低溫會(huì)造成放氧復(fù)合體受損，PSⅡ反應(yīng)中心各單位之間的能量流通不暢，以及PSⅡ受體側(cè)電子由初級(jí)電子受體(QA)向次級(jí)電子受體(QB)的傳遞過程受阻。伴隨溫度降低，南極假山毛櫸的VK、VL、ABS/RC、TRO/RC和DIO/RC逐漸升高，RC/CSO逐漸減少，與前人研究結(jié)果相似；-15 ℃時(shí)RC/CSO出現(xiàn)短暫顯著回升，推測(cè)是南極假山毛櫸面對(duì)低溫脅迫的應(yīng)激反應(yīng)，即通過增加PSⅡ單位面積光合機(jī)構(gòu)含有的反應(yīng)中心數(shù)量，以加大光能吸收量，彌補(bǔ)由于PSⅡ受體側(cè)電子傳遞受阻而缺失的能量。

DUARTE等[20]利用IBR評(píng)價(jià)法，以JIP-test參數(shù)為數(shù)據(jù)源構(gòu)建了光化學(xué)脅迫指數(shù)，證實(shí)了該參數(shù)與環(huán)境脅迫程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)IBR值與溫度呈顯著負(fù)相關(guān)，與DUARTE等[20]的結(jié)論相似。本研究還觀察到，與Fv/Fm和PIABS不同，IBR與相對(duì)葉綠素含量亦存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，可能預(yù)示IBR對(duì)低溫脅迫的反映更具有廣泛性。

多項(xiàng)研究顯示，5 ℃的低溫會(huì)引起Fv/Fm和PIABS顯著降低[6-8，11]；本研究發(fā)現(xiàn)：高于5 ℃時(shí)南極假山毛櫸葉片的Fv/Fm和IBR無(wú)顯著變化，高于15 ℃時(shí)PIABS無(wú)顯著變化，表明南極假山毛櫸葉片PSⅡ的溫度適應(yīng)性強(qiáng)，這可能是南極假山毛櫸耐寒性強(qiáng)的生理基礎(chǔ)之一。研究還發(fā)現(xiàn)：冰凍脅迫對(duì)PSⅡ的光吸收能力抑制明顯，預(yù)示在南極假山毛櫸的生長(zhǎng)季需要預(yù)防零度以下的寒潮侵襲。STECCONI等[24]發(fā)現(xiàn)南極假山毛櫸的最適生長(zhǎng)溫度為18.5 ℃/7.0 ℃(晝/夜)，回歸分析顯示IBR的最小值出現(xiàn)在22 ℃，這一溫度與上述研究結(jié)果仍有差距，可能與低溫處理時(shí)間，以及參與計(jì)算IBR的參數(shù)種類有關(guān)，還需進(jìn)一步探究。