水楊酸誘導(dǎo)紫楠對(duì)炭疽病的抗性

侯盼盼，陳安良，費(fèi)莉玢，馬良進(jìn)

（浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

楠木自古以來(lái)被譽(yù)為江南四大名木之首，國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，主要包括樟科Lauraceae潤(rùn)楠屬M(fèi)achilus和楨楠屬Phoebe植物，多為高大喬木，樹干通直，樹型優(yōu)美，且具有驅(qū)蟲等功效，深受人們喜愛，是中國(guó)重要的景觀樹種和經(jīng)濟(jì)樹種[1-2]。炭疽病是近年來(lái)危害楠木健康的主要病害之一，侵染葉片邊緣、葉尖，病斑呈灰褐色至暗褐色，枝部感染處為黑褐色，病健交界處明顯。此前學(xué)者在廣西南寧市良鳳江國(guó)家森林苗圃基地和博白縣林業(yè)科學(xué)研究所，以及廣東省肇慶市北嶺山珍貴樹種種植基地調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病害發(fā)生嚴(yán)重[3-4]。目前，關(guān)于楠木炭疽病防治研究相對(duì)較少，且僅限于病原菌鑒定及其發(fā)病規(guī)律，植物誘導(dǎo)抗性用于楠木病害防治未見報(bào)道?；瘜W(xué)防治是林業(yè)病害防治中最快速、有效的方法。然而，重復(fù)使用化學(xué)殺菌劑已經(jīng)導(dǎo)致許多問題，如抗藥性、環(huán)境污染、化學(xué)殘留等。植物抗病性是利用植物自身的免疫性來(lái)對(duì)抗病原物的侵染，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。很多研究證明通過(guò)天然或化學(xué)合成物等可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，抵抗病原物入侵，從而達(dá)到防治效果。水楊酸(SA)是一種內(nèi)源性激發(fā)子，是信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中的重要組成部分，參與調(diào)控植物生理生化等過(guò)程[5-6]。水楊酸可以誘導(dǎo)植物局部獲得性抗性和系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)[7-9]，在1979年對(duì)感染花葉病毒(TMV)的煙草Nicotiana tabacum栽培種Xanthi-NC研究中首次證明[10]，隨后人們通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)對(duì)水楊酸可以提高植物的抗病性加以驗(yàn)證，如山茶Camellia japonica灰斑病[11]、桉樹Eucalyptus焦枯病[12]、油茶C.oleifera炭疽病[13]等。本研究分析了SA對(duì)楠木炭疽病的誘導(dǎo)抗性，測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)的變化來(lái)探究其作用機(jī)理，旨在為病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

紫楠Phoebe sheareri又名紫金楠、金絲楠等，由建德市欣林林木服務(wù)中心提供，為2年生盆栽苗。供試菌株膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides由浙江農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)學(xué)科菌種儲(chǔ)存室提供。

1.2 不同質(zhì)量濃度SA誘導(dǎo)效果測(cè)定

1.2.1 不同質(zhì)量濃度SA誘導(dǎo)對(duì)楠木炭疽病病斑大小的影響 配制質(zhì)量濃度為500、200、100、50 mg·L-1水楊酸溶液(pH 6.8)進(jìn)行噴霧試驗(yàn)，約30 mL·株-1，1 d后重復(fù)噴灑，并設(shè)置無(wú)菌水對(duì)照。5 d后采集葉片，選擇心葉下完全展開的功能葉片，用滅菌剪刀取樣，樣品成熟度保持一致。每處理3株，4次重復(fù)。采用孢子懸浮液進(jìn)行離體刺傷接種，以不刺穿葉片為宜。于25 ℃下12 h光照12 h黑暗保濕培養(yǎng)，7 d后統(tǒng)計(jì)葉片發(fā)病情況，采用網(wǎng)格法測(cè)病斑面積，重復(fù)3次取平均值，計(jì)算病斑減小率。病斑減小率=(對(duì)照處理病斑面積-誘導(dǎo)處理病斑面積)/對(duì)照處理病斑面積×100%

1.2.2 不同質(zhì)量濃度SA誘導(dǎo)與楠木生理指標(biāo)變化測(cè)定 選取長(zhǎng)勢(shì)良好大小一致的2年生紫楠植株，配置SA的最終質(zhì)量濃度為500、200、100、50 mg·L-1，均勻噴灑于植株上，以溶液布滿葉片不流下為宜。以無(wú)菌水噴灑作為對(duì)照，1 d后重復(fù)噴灑，使植物充分吸收，5 d后采集長(zhǎng)勢(shì)均一的成熟葉片進(jìn)行生理測(cè)定，包括可溶性蛋白質(zhì)、SOD、POD、CAT，每處理3次重復(fù)?？扇苄缘鞍踪|(zhì)采用紫外吸收法測(cè)定[14]。取紫楠 葉片0.5 g，按照1∶9的體積比加 入9倍體 積0.1 mol·L-1磷 酸緩沖液(pH 7)，5 000 r·min-1離心10 min，上清液為蛋白質(zhì)提取液。取蛋白質(zhì)原液0.5 mL稀釋至5 mL，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)取280 nm及260 nm處的光密度D(280)和D(260)，以pH=7.0磷酸緩沖液進(jìn)行空白調(diào)0。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(g·L-1)=1.45×D(280)-0.74×D(260)。其中1.45和0.74為校正值。SOD活性測(cè)定：本研究通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，氧化羥胺形成子糾纏亞硝酸鹽，在顯色劑的反應(yīng)下呈現(xiàn)紫紅色，根據(jù)南京建成生物工程研究所測(cè)試盒步驟進(jìn)行測(cè)定，用可見光分光光度計(jì)測(cè)其光密度。組織中SOD活力定義：每克組織在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)活力單位(1 U=16.67 nkat)。SOD活力(16.67 nkat·g-1)=[(對(duì)照光密度-測(cè)定光密度)÷對(duì)照光密度]÷50%×反應(yīng)液總體積(mL)÷取樣量(mL)÷勻漿液濃度(kg·L-1)。CAT活性測(cè)定：CAT分解過(guò)氧化氫(H2O2)的反應(yīng)可通過(guò)加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，按照南京建成生物工程研究所測(cè)試盒處理結(jié)果在405 nm處測(cè)定其變化量，可計(jì)算出CAT的活力。CAT活力定義：每毫克組織蛋白每秒種分解1 μmol的H2O2的量為1個(gè)活力單位。CAT活力(16.67 nkat·g-1)=(對(duì)照光密度-測(cè)定光密度)×271÷60÷取樣量(mL)÷勻漿液濃度(kg·L-1)。POD活性測(cè)定：過(guò)氧化氫酶可催化過(guò)氧化氫反應(yīng)，根據(jù)南京建成生物工程研究所測(cè)試盒測(cè)定420 nm處可見光光密度變化來(lái)計(jì)算酶活性。組織中POD活力定義：在37 ℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化1 μg底物的酶量定義為一個(gè)活力單位(1 U=16.67 nkat)。POD活力(16.67 nkat·g-1)=[(對(duì)照光密度-測(cè)定光密度)÷(12×1 cm比色光徑)]×反應(yīng)液總體積(mL)÷取樣量(mL)÷反應(yīng)時(shí)間(30 min)÷勻漿液濃度(kg·L-1)×1 000。

1.2.3 不同質(zhì)量濃度SA對(duì)孢子萌發(fā)率的影響測(cè)定 為確定SA對(duì)孢子萌發(fā)是否有影響，配置含SA的最終質(zhì)量濃度為0、50、100、200、500 mg·L-1的楠木炭疽病病原菌孢子懸浮液，采用凹玻片萌發(fā)法[14]，調(diào)節(jié)pH至6.8進(jìn)行25 ℃全黑暗保濕培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，12 h后觀察孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)率。孢子萌發(fā)率=已萌發(fā)孢子數(shù)/觀察孢子總數(shù)×100%；

1.3 SA處理和炭疽病接種后楠木生理指標(biāo)變化測(cè)定

根據(jù)質(zhì)量濃度誘導(dǎo)結(jié)果，選用最適宜質(zhì)量濃度SA進(jìn)行噴霧處理，1 d后重復(fù)噴施，對(duì)照為等量無(wú)菌水。本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理：在第2次SA處理2 h后活體接種(A)；SA處理不接種(B)；無(wú)菌水處理并接種(C)；無(wú)菌水處理不接種(ck)。每處理3株，4次重復(fù)。采用孢子懸浮液針刺接種，脫脂棉保濕處理。不同處理在第2次SA或無(wú)菌水噴施后1、2、3、5、7、10、15 d采集生長(zhǎng)狀況一致的葉片，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，進(jìn)行后續(xù)生理指標(biāo)變化測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度SA對(duì)紫楠的誘導(dǎo)效果

2.1.1 對(duì)病斑大小的影響 由圖1可以看出：不同質(zhì)量濃度的SA對(duì)紫楠均具有誘導(dǎo)作用，對(duì)病斑抑制效果差異顯著(P＜0.05)。與無(wú)菌水噴灑處理相比SA質(zhì)量濃度為100 mg·L-1誘導(dǎo)植物葉片病斑減小率最高，達(dá)64.28%，其次是50和200 mg·L-1，誘導(dǎo)效果為59.8%、56.72%，500 mg·L-1誘導(dǎo)效果最差，其中各質(zhì)量濃度誘導(dǎo)植物病斑大小差異顯著。

2.1.2 對(duì)楠木炭疽病孢子萌發(fā)的影響 結(jié)果表明(圖1)：低質(zhì)量濃度SA處理孢子萌發(fā)率與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，即對(duì)孢子萌發(fā)無(wú)明顯抑制作用，當(dāng)SA質(zhì)量濃度為200、500 mg·L-1時(shí)抑制作用顯著(P＜0.05)，分別為69.58%和34.75%，同低質(zhì)量濃度相比差異較大。

圖1 不同質(zhì)量濃度SA處理對(duì)病斑大小及孢子萌發(fā)的影響Figure 1 Effect of different concentrations of SA treatment on lesion size and spore germination

2.1.3 對(duì)可溶性蛋白質(zhì)的影響 從圖2可以看出：不同質(zhì)量濃度SA均可誘導(dǎo)可溶性蛋白質(zhì)的增加(P＜0.05)，100 mg·L-1所誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度是對(duì)照的2.11倍，50和200 mg·L-1的誘導(dǎo)效果差異不顯著，與對(duì)照相比差異顯著，分別是對(duì)照的1.77和1.69倍。500 mg·L-1SA誘導(dǎo)后，可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度較其他處理低，但顯著高于對(duì)照(P＜0.05)。

2.1.4 對(duì)SOD的影響 SOD是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，SA施用后引起植株SOD活性升高(圖2)。其中500和200 mg·L-1與對(duì)照之間無(wú)顯著差異，SA質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時(shí)酶活性高于50 mg·L-1時(shí)的酶活性，差異顯著(P＜0.05)。表明不同質(zhì)量濃度SA對(duì)植物中SOD酶活性的影響不同。

2.1.5 對(duì)CAT的影響 CAT活性隨SA質(zhì)量濃度的上升表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)(圖2)，500 mg· L-1質(zhì)量濃度處理與對(duì)照的CAT相比無(wú)顯著差異，200、100、50 mg·L-1處理差異顯著(P＜0.05)，均能使CAT活性增加。其中100 mg·L-1的SA處理對(duì)楠木植株CAT活性誘導(dǎo)效果最好，是對(duì)照的2.03倍。

圖2 不同質(zhì)量濃度SA處理對(duì)可溶性蛋白質(zhì)、SOD、CAT和POD的影響Figure 2 Effect of different concentrations of SA treatment on soluble protein, SOD, CAT and POD

2.1.6 對(duì)POD的影響 不同質(zhì)量濃度SA處理對(duì)POD活性的影響與CAT趨勢(shì)相似(圖2)，均為隨SA質(zhì)量濃度的增加表現(xiàn)為先上升后下降。100 mg·L-1SA誘導(dǎo)的POD活性最高，是對(duì)照的1.3倍。200和50 mg·L-1誘導(dǎo)的CAT活性無(wú)顯著差異，但顯著高于500 mg·L-1和對(duì)照處理。不同質(zhì)量濃度SA均可引起POD活性增加。上述研究表明：不同質(zhì)量濃度SA對(duì)楠木誘導(dǎo)效果均存在差異，500 mg·L-1誘導(dǎo)效果最差，100 mg·L-1誘導(dǎo)效果最好，因此選擇100 mg·L-1的SA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 SA處理和炭疽病接種引起的楠木生理指標(biāo)變化

2.2.1 對(duì)可溶性蛋白質(zhì)的影響 從圖3可以看出：不同處理均可引起紫楠葉片可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增加。SA處理后其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在1～5 d持續(xù)增加，5 d時(shí)達(dá)峰值，處理A在第7天達(dá)峰值，隨后下降，可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度顯著高于未經(jīng)SA處理過(guò)的處理C和ck。處理A效果最好，第7天時(shí)是ck的2.57倍，經(jīng)SA處理過(guò)的植株第15天可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度仍顯著高于對(duì)照，處理C在第1～3天升高隨后下降，趨勢(shì)相較于A處理和B處理趨勢(shì)較為平緩。15 d時(shí)SA處理過(guò)的植株可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度顯著高于對(duì)照，因此SA可以誘導(dǎo)紫楠植株可溶性蛋白質(zhì)增加。

2.2.2 對(duì)SOD的影響 本研究SA處理均可引起紫楠葉片SOD活性增加(圖3)，隨SA的作用時(shí)間先逐漸升高后緩慢下降。當(dāng)SA作用時(shí)間為7 d時(shí)，處理A的SOD活性達(dá)最大值，是ck的1.21倍，之后開始下降，處理A和處理B的SOD活性始終顯著高于處理C和ck。

2.2.3 對(duì)CAT的影響 SA誘導(dǎo)后可引起紫楠體內(nèi)CAT活性增加(圖3)，有利于增強(qiáng)植株抗病性。紫楠葉片經(jīng)SA處理和接種處理后，CAT活性在第5天達(dá)到峰值，處理A是ck的2.04倍，處理B是ck的1.63倍，5 d后CAT活性下降。處理C的CAT活性雖有增加但到后期與ck相比差異不顯著。

2.2.4 對(duì)POD的影響 100 mg·L-1的SA誘導(dǎo)后，植株P(guān)OD活性迅速升高(圖3)，處理A與處理B的POD活性具有基本相似的變化趨勢(shì)，處理A相較于處理B遲一些達(dá)到最大值，且POD活性是ck的1.46倍，SA誘導(dǎo)15 d后的植株P(guān)OD活性仍顯著高于未誘導(dǎo)的植株。

3 討論

誘抗劑有著更好的抗病性和低毒性[15-16]。目前，誘導(dǎo)劑在農(nóng)業(yè)等方面應(yīng)用廣泛，在林業(yè)方面研究相對(duì)較少。將誘導(dǎo)劑應(yīng)用于林業(yè)實(shí)踐可減少化學(xué)殺菌劑的使用，與殺菌劑、生物防治等相結(jié)合可達(dá)到更好的效果[17-19]。當(dāng)SA質(zhì)量濃度低于500 mg·L-1時(shí)對(duì)孢子萌發(fā)無(wú)影響，可以證明低質(zhì)量濃度外源SA的施用對(duì)病原菌孢子無(wú)直接毒力。本研究證實(shí)：不同質(zhì)量濃度SA對(duì)紫楠均具有誘導(dǎo)抗性作用。100 mg·L-1為SA最適宜質(zhì)量濃度，酶活性均達(dá)到最大值，差異顯著。SA處理后可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，SOD、CAT、POD活性先上升然后下降至穩(wěn)定水平，實(shí)驗(yàn)持續(xù)了15 d，所測(cè)結(jié)果仍高于正常水平，其中CAT變化最為明顯，經(jīng)SA誘導(dǎo)的紫楠接種或不接種處理，生理指標(biāo)活性均顯著高于對(duì)照，這與山茶[11]、橡膠樹Hevea brasiliensis[20]等抗性誘導(dǎo)研究結(jié)果一致。

SA是存在于植物體內(nèi)的內(nèi)源性生長(zhǎng)物質(zhì)，可以引起植物體內(nèi)H2O2濃度升高，促進(jìn)H2O2生成的化合物，誘導(dǎo)SAR相關(guān)蛋白及防御酶等活性的增加，促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)[21-22]。外源SA可以誘發(fā)植物觸發(fā)病理相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，在誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的同時(shí)大量積累病程相關(guān)蛋白。外源SA的應(yīng)用可誘導(dǎo)植物內(nèi)源性CAT和POD活性增加，以及相關(guān)基因的表達(dá)，能引發(fā)植物的誘導(dǎo)抗性[23]。POD除了具有解毒作用外，還是植物體內(nèi)多種次生代謝產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵調(diào)控酶之一，植物次生代謝產(chǎn)物參與了植物對(duì)病原體的防御反應(yīng)，SOD在清除高毒性和不穩(wěn)定活性氧中起重要作用，CAT、POD和SOD被認(rèn)為是保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的主要抗氧化系統(tǒng)，多種酶活性的升高可能是使植物體產(chǎn)生抗性，抵抗病原菌侵染的重要原因。因此，SA可以誘導(dǎo)楠木對(duì)病原菌的入侵產(chǎn)生抗性，為防治提供依據(jù)。