Cr6+、Pb2+和Ni2+對萊茵衣藻的毒性效應研究

魏思潔，馬馨月，張 超，柯 檀，張渝蕊，陳蘭洲

(武漢大學資源與環(huán)境科學學院，湖北 武漢 430079)

隨著我國工業(yè)化的快速發(fā)展，大量污染物被釋放后進入水體，在污染水環(huán)境的同時，也對人類健康和生存造成嚴重的影響[1]。為了控制廢水污染物對水環(huán)境造成的危害，我國規(guī)定了廢水中污染物的理化指標，如化學需氧量(COD)、總氮(TN)、總磷(TP)等的標準限值[2]。但即使廢水中污染物的理化指標達標，廢水中污染物仍會對水生生物產(chǎn)生一系列毒性效應，最終可能會威脅水生態(tài)系統(tǒng)的平衡[2]。因此，除了根據(jù)污染物理化指標來評價廢水排放對水環(huán)境的危害外，還應針對廢水中污染物對水生生物的綜合毒性效應進行檢測，以達到對水環(huán)境進行綜合評價的目的。

我國水體重金屬污染問題十分突出[3]，江河湖庫底質(zhì)的重金屬污染率相當高，并且隨河流攜帶入海的重金屬污染物總量巨大，這些重金屬污染物可能會對整個水生態(tài)系統(tǒng)造成負面影響[4]。藻類作為水體中的初級生產(chǎn)者在水生態(tài)系統(tǒng)中具有十分重要的作用，同時藻類由于個體小、繁殖快、易于培養(yǎng)且對污染物敏感，被廣泛應用于廢水監(jiān)測[5]。重金屬污染物如Cr6+、Pb2+和Ni2+進入水體后，可對藻細胞產(chǎn)生生長抑制、生理代謝混亂等毒性效應[6]。萊茵衣藻作為模式生物與許多高等動植物在某些基因和生理機制上具有同源性，利用萊茵衣藻開展重金屬的水環(huán)境生物效應研究具有重要的意義[7]。因此，本研究以萊茵衣藻為受試生物，利用快速葉綠素熒光誘導動力學分析和毒理測試方法，開展3種典型重金屬(Cr6+、Pb2+和Ni2+)對萊茵衣藻的單一毒性效應試驗，分析萊茵衣藻的光合活性和抗氧化系統(tǒng)對不同種類和不同濃度重金屬毒性效應的響應情況，以為萊茵衣藻作為指示生物應用于重金屬污染水體監(jiān)測提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)藻種來自于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻類藻種庫(FACHB)。無菌操作下將藻種轉(zhuǎn)接至新鮮滅菌過的SE(Selenite Enrichment)培養(yǎng)基中，于光照培養(yǎng)箱中以恒溫20℃±1℃、光強50 μE/(m2·s)、12 h∶12 h明暗交替光照周期條件下，通氣培養(yǎng)至生長對數(shù)期。

1.2 試驗方法

1.2.1 重金屬處理萊茵衣藻的方法

取100 mL SE培養(yǎng)基置于若干個錐形瓶中，向錐形瓶中分別加入不同體積的K2Cr2O7母液(1 g/L)，使Cr6+的最終濃度分別為0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L；另在錐形瓶中分別加入不同體積的Pb(NO3)2母液(1 g/L)，使Pb2+的最終濃度分別為0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L；另在錐形瓶中分別加入不同體積的Ni(NO3)2母液(5 g/L)，使Ni2+的最終濃度分別為0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L。將含有重金屬污染物的培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌，備用。取100 mL培養(yǎng)至生長對數(shù)期的萊茵衣藻，離心收集藻體，再經(jīng)無菌操作轉(zhuǎn)移至上述含不同濃度重金屬污染物的培養(yǎng)基中，混勻后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)不同的處理時間后取樣測定藻液的參數(shù)，每組樣品設(shè)置3個平行樣。

1.2.2 葉綠素熒光參數(shù)的測定方法

取2 mL經(jīng)重金屬處理后的藻液，避光放置15 min后，采用便攜式植物效率分析儀(PEA，Hanasatech?，U.K.)于室溫、遮光條件下測定萊茵衣藻葉綠素熒光參數(shù)，激發(fā)光強為最大光強的50%[約為1 500 μE/(m2·s)]，記錄時間為5 s。利用測得的葉綠素熒光參數(shù)，經(jīng)過處理后可繪制葉綠素熒光誘導動力學曲線，并可計算得到其他關(guān)于萊茵衣藻光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的光合參數(shù)，包括最大光化學量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、單位面積內(nèi)反應中心數(shù)量(RC/CS0)、照光2 ms時有活性的反應中心的開放程度(ET0/TR0)和反應中心吸收的光能用于電子傳遞的量子產(chǎn)額(ET0/ABS)[8]。

1.2.3 葉綠素a含量的測定方法

藻液中葉綠素a含量的測定采用乙醇-分光光度法[8]。取5 mL經(jīng)重金屬處理后的藻液，離心(8 000 r/min，10 min，4℃)后棄去上清液，收集藻體；然后加入5 mL 95%乙醇，搖勻置于4℃冰箱24 h后，再次離心(8 000 r/min，10 min，4℃)，取上清液測定665 nm和649 nm處的吸光度值，并通過以下公式計算得到藻液中葉綠素a含量：

葉綠素a含量=13.95×OD665-6.88×OD649

(1)

式中：葉綠素a含量為藻液中葉綠素a含量(mg/L)；OD665和OD649分別為665 nm和649 nm處的吸光度值。

1.2.4 藻類丙二醛(MDA)含量的測定方法

取5 mL經(jīng)重金屬處理后的藻液，離心(8 000 r/min，10 min，4℃)后收集藻體，用磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.8)洗滌3次；然后加入5 mL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.8)，冰浴超聲破碎后離心(8 000 r/min，10 min，4℃)，得到的上清液即為粗酶提取液。

藻類丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸法[9]。取1 mL粗酶提取液，加入2 mL 10%三氯乙酸、2 mL 0.6%硫代巴比妥酸，混合均勻后置于100℃水浴20 min；然后冷卻至室溫后，測定其在450 nm、532 nm和600 nm處的吸光度值，并通過以下公式計算藻液中MDA含量(最終結(jié)果以單位葉綠素a的MDA含量表示)：

MDA=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

(2)

式中:MDA為藻液中MDA含量(mmol/mg)；OD532、OD600和OD450分別為532 nm、600 nm和450 nm處的吸光度值。

1.2.5 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定方法

藻液中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍法[9]。取0.1 g考馬斯亮藍(G-250)溶于50 mL 95%乙醇中，混勻后加入100 mL 85%濃磷酸，用蒸餾水定容至1 000 mL；然后取1 mL粗酶提取液加入5 mL G-250試劑并混勻，5 min后測定其在595 nm處的吸光度值，再根據(jù)可溶性蛋白質(zhì)吸光度的標準曲線計算藻液中可溶性蛋白質(zhì)含量。本次試驗使用結(jié)晶牛血清白蛋白為標準蛋白。

1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定方法

藻液中超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍四唑法[9]。向樣品管中加入1 mL粗酶提取液，向?qū)φ展苤屑尤? mL磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.8)；然后分別加入3.1 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L，含100 μmol/L EDTA-Na2)、0.3 mL甲硫氨酸溶液(220 mmol/L)、0.3 mL氯化硝基四氮唑藍溶液(1.25 mmol/L)和0.3 mL核黃素溶液(33 μmol/L)，混勻后，取其中一組對照管于避光條件下反應，另一組對照管和樣品管于4 000 Lux日光燈下反應，20 min后測定對照管和樣品管中反應液在560 nm處的吸光度值，通過以下公式計算酶活：

SOD=2×(ODCK-OD560)/ODCK

(3)

式中:SOD為超氧化物歧化酶活性(U/mg)；ODCK和OD560分別為對照管和樣品管中反應液在560 nm處的吸光度值。

1.2.7 重金屬對萊茵衣藻的毒性效應評價方法

藻液經(jīng)重金屬處理72 h后，以重金屬濃度的對數(shù)值(lgC)為橫坐標，以重金屬對萊茵衣藻的3項毒性評價指標(Fv/Fm、MDA含量、SOD活性)的相對抑制率為縱坐標，分別對數(shù)據(jù)進行線性擬合，再根據(jù)各個毒性評價指標的線性擬合優(yōu)度(R2)和半數(shù)效應濃度(EC50)值為標準，選取最敏感的毒性評價指標進行后續(xù)評價。毒性評價指標的相對抑制率計算公式如下：

相對抑制率(%)=(S0-Sm)/S0×100%

(4)

式中:S0為對照組的毒性評價指標數(shù)值，Sm為樣品組的毒性評價指標數(shù)值。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析方法

本文利用Origin軟件中的線性擬合功能得到毒性評價指標相對抑制率對重金屬濃度對數(shù)值的擬合直線及相關(guān)擬合參數(shù)，再利用SPSS軟件中單因素方差分析(One-way ANOVA)中的Duncant法進行3項毒性評價指標的差異性分析(p<0.05)。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 重金屬脅迫對萊茵衣藻葉綠素熒光誘導動力學曲線的影響

不同重金屬濃度和不同時間處理條件下萊茵衣藻葉綠素a熒光誘導動力學曲線的對比，見圖1。O相、J相、I相和P相熒光值分別為暴露時間50 μs、2 ms、30 ms和葉綠素a熒光誘導動力學曲線最高峰處的熒光強度[10]。

由圖1可見，經(jīng)重金屬處理24 h后，萊茵衣藻葉綠素a熒光強度隨重金屬濃度的增加逐漸下降，此時J相、P相熒光值雖然強度減弱但仍可被觀察到；經(jīng)重金屬處理72 h后，在部分高濃度重金屬脅迫下P相熒光值隨著處理時間的增加，其強度越來越弱，萊茵衣藻葉綠素a熒光誘導動力學曲線幾乎為平直狀態(tài)；在整個處理過程中，Cr6+和Pb2+處理組葉綠素a熒光強度比Ni2+處理組下降得更迅速且下降幅度更大。

2.2 重金屬脅迫對萊茵衣藻光合參數(shù)的影響

不同重金屬濃度和不同時間處理條件下萊茵衣藻光合參數(shù)變化的對比，見表1和圖2。

由表1和圖2可知，在加入重金屬后，隨著時間的推移和重金屬濃度的增加，萊茵衣藻的光合參數(shù)Fv/Fm、RC/CS0、ET0/TR0和ET0/ABS顯著下降且下降幅度越來越大，高濃度重金屬處理組的部分光合參數(shù)值接近于0，表明高濃度重金屬明顯抑制了萊茵衣藻的光合參數(shù)，但隨著Ni2+濃度的增加，萊茵衣藻的光合參數(shù)ET0/TR0和ET0/ABS的變化并不顯著。

2.3 重金屬脅迫對萊茵衣藻MDA含量的影響

不同濃度重金屬和不同時間處理條件下萊茵衣藻MDA含量變化的對比，見圖3。

圖1 不同重金屬濃度和不同時間處理條件下萊茵衣藻葉綠素a熒光誘導動力學曲線的對比Fig.1 Comparison of chlorophyll fluorescence induction kinetics curves of C.reinhardtii processed by different concentrations of heavy metals in various time period注：CK代表無重金屬脅迫的對照組。下同。

表1 不同重金屬濃度和不同時間處理條件下萊茵衣藻光合參數(shù)變化的對比Table 1 Comparison of photosynthetic parameter changes of C.reinhardtii processed by different concentrations of heavy metals in various time periods

續(xù)表1

光合參數(shù)處理時間/d不同濃度Pb2+處理0(CK)2mg/L4mg/L6mg/L8mg/L10mg/L10.343±0.003a0.337±0.002b0.335±0.002b0.302±0.003c0.275±0.002d0.233±0.002eET0/TR020.321±0.003a0.315±0.003b0.216±0.002c0.220±0.002c0.197±0.002d0.158±0.002e30.321±0.002a0.222±0.002b0.193±0.002c0.118±0.002d0.056±0.002e0.000±0.001f1329.66±35.59a325.56±26.67a302.12±30.34ab294.24±28.97ab283.24±28.28ab264.06±28.97bRC/CS02325.42±25.28a275.33±10.19b211.45±9.55c155.98±7.49d103.58±11.87e80.98±3.13e3307.21±29.99a164.62±12.83b123.59±15.97c92.83±7.17d65.88±5.41de39.62±6.76e光合參數(shù)處理時間/d不同濃度Ni2+處理0(CK)5mg/L10mg/L15mg/L20mg/L25mg/L10.264±0.0340.261±0.0280.260±0.0190.261±0.0220.249±0.0140.252±0.014ET0/ABS20.256±0.0480.256±0.0350.258±0.0350.262±0.0250.251±0.0260.257±0.02230.258±0.0270.248±0.0250.247±0.0240.232±0.0220.226±0.0100.221±0.01410.367±0.0360.368±0.0320.368±0.0340.367±0.0320.361±0.0330.362±0.028ET0/TR020.361±0.0390.360±0.0380.366±0.0380.372±0.0310.367±0.0400.369±0.03230.357±0.0390.354±0.0400.353±0.0310.323±0.0340.347±0.0310.359±0.0321552.16±36.07a534.85±21.51a503.75±39.16ab494.80±38.08ab487.86±40.14ab453.99±44.30bRC/CS02549.48±26.80a482.15±10.14b428.30±44.40bc394.78±29.30cd356.35±36.61d399.40±48.91cd3549.74±41.36a352.92±11.51b300.23±24.94c268.69±41.95c149.33±15.97d147.79±11.87d

注：a、b、c、d、e、f表示使用單因素方差分析中的Duncant法得出的不同數(shù)據(jù)之間差異的顯著性(p<0.05)。下同。

圖2 不同濃度重金屬和不同時間處理條件下萊茵衣藻PSⅡ最大光化學量子產(chǎn)量(Fv/Fm)變化的對比Fig.2 Comparison of changes of maximum quantum yield of PS II photochemistry (Fv/Fm) of C.reinhardtii processed by different concentrations of heavy metals in various time period

圖3 不同濃度重金屬和不同時間處理條件下萊茵衣藻MDA含量變化的對比Fig.3 Comparison of changes of MDA content of C.reinhardtii processed by different concentration of heavy metals in various time period

MDA是由膜脂過氧化產(chǎn)生的，其含量的高低反映了細胞膜被氧化的程度，也在一定程度上反映了細胞內(nèi)活性氧(ROS)的水平[11]。由圖3可見，經(jīng)Pb2+和Ni2+處理2 d后，萊茵衣藻中MDA含量增加并不明顯，甚至有部分處理組萊茵衣藻中MDA含量下降，但Cr6+脅迫下萊茵衣藻中MDA含量顯著增加；經(jīng)不同重金屬處理3 d后，萊茵衣藻中MDA含量均上升，其中Ni2+處理組萊茵衣藻中MDA含量上升不明顯，而Cr6+和Pb2+處理組上升顯著且呈梯度上升。

2.4 重金屬脅迫對萊茵衣藻SOD活性的影響

不同濃度重金屬和不同時間處理條件下萊茵衣藻SOD活性變化的對比，見圖4。

SOD是一種清除生物體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的酶，它能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應，減少自由基對生物體的損害[12]。由圖4可見，經(jīng)Cr6+和Pb2+處理1 d后，部分處理組萊茵衣藻中SOD活性增強，但Ni2+處理組SOD活性一直降低；經(jīng)不同重金屬處理3 d后，萊茵衣藻中SOD活性均顯著降低，且重金屬濃度越大，萊茵衣藻中SOD活性降低速度越快。

圖4 不同濃度重金屬和不同時間處理條件下萊茵衣藻SOD活性變化的對比Fig.4 Comparison of changes of SOD activity of C.reinhardtii processed by different concentrations of heavy metals in various time period

2.5 重金屬脅迫對萊茵衣藻的毒性效應評價

不同重金屬對萊茵衣藻3項毒性評價指標的相對抑制率與重金屬濃度的線性擬合優(yōu)度對比，見圖5。

圖5 不同重金屬脅迫下萊茵衣藻3項毒性評價指標的相對抑制率與重金屬濃度的線性擬合優(yōu)度對比Fig.5 Comparison of linear goodness of fit of relative inhibition rates among three toxicity evaluation indexes of heavy metals to C.reinhardtii with heavy metal concentrations注：lgC為重金屬濃度的對數(shù)值

由圖5可見，不同重金屬對萊茵衣藻3項毒性評價指標的相對抑制率與重金屬濃度的線性擬合優(yōu)度R2值排序均為Fv/Fm>SOD活性>MDA含量，即萊茵衣藻光合參數(shù)Fv/Fm的擬合優(yōu)度最佳。

通過比較不同重金屬脅迫下萊茵衣藻3項毒性指標的EC50值(見表2)可知：各重金屬對萊茵衣藻毒性評價指標中Fv/Fm的EC50值最小，結(jié)合圖5結(jié)果可知，3項毒性評價指標中，F(xiàn)v/Fm對重金屬的毒性響應最為敏感，表明萊茵衣藻光合參數(shù)Fv/Fm是表征重金屬對萊茵衣藻毒性效應的最佳參數(shù)。

表2 不同重金屬脅迫下萊茵衣藻3項毒性評價指標的EC50值Table 2 EC50 values of three toxicity evaluation indexes of C.reinhardtii under the stress of different heavy metals

重金屬對萊茵衣藻毒性評價指標的相對抑制率達到50%時所需的重金屬濃度越低，說明該重金屬對萊茵衣藻的毒性效應越強。由表2可知，3種重金屬對萊茵衣藻的毒性效應強度排序為Cr6+>Pb2+>Ni2+，表明萊茵衣藻對3種重金屬的毒性效應響應程度存在一定的差異。

3 討論與分析

當藻細胞受到外界污染物刺激時，會產(chǎn)生大量的ROS，若未被及時清除就會引起脂質(zhì)過氧化、酶失活等損傷，導致藻細胞活性降低[18]。部分Pb2+和Ni2+處理組萊茵衣藻中MDA含量在24 h內(nèi)有所降低(見圖3)，可能是因為內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)可以清除或修復受損的生物分子，SOD成功地清除了ROS，減少了MDA的生成，從而保持了細胞膜功能和結(jié)構(gòu)的完整性[19]。Cr6+和Pb2+處理組24 h后萊茵衣藻中SOD活性有所上升(見圖4)，可能原因是藻細胞在短期內(nèi)迅速做出反應，啟動保護機制，SOD合成增加以保持自由基平衡[20]；但Cr6+處理組萊茵衣藻中MDA含量沒有降低，可能是由于萊茵衣藻對Cr6+的毒害最敏感，產(chǎn)生的MDA含量遠大于MDA被清除的含量。隨著處理時間的增加，重金屬處理3 d后萊茵衣藻中SOD活性顯著降低，且重金屬濃度越大，其SOD活性降低速度越快，可能是由于藻細胞的保護機制仍無法完全消除ROS，導致藻細胞受到ROS的損傷隨著時間的推移加劇，使得DNA本身或其轉(zhuǎn)錄過程受到影響，且SOD結(jié)構(gòu)被破壞后補充量不足，導致后期萊茵衣藻中SOD活性降低。3種重金屬處理72 h后，萊茵衣藻中MDA含量增加和SOD活性降低，說明3種重金屬最終都會對萊茵衣藻造成一定的氧化損傷，但萊茵衣藻對Ni2+有一定的耐受性，而對Cr6+比較敏感，故在短期內(nèi)Cr6+就對萊茵衣藻造成了較強的氧化損傷。

Fv/Fm參數(shù)可由快速葉綠素a熒光誘導動力學分析方法直接測得，不需要經(jīng)過數(shù)據(jù)的輸出和計算過程，因此適合作為4種光合參數(shù)的代表。同時，快速葉綠素a熒光誘導動力學分析作為毒性評價的探針，具有操作簡便、快速有效且攜帶方便等優(yōu)點，在污染物的環(huán)境監(jiān)測中具有重要意義[21]。根據(jù)試驗結(jié)果(見圖5和表2)，選取Fv/Fm參數(shù)作為后續(xù)評價重金屬對萊茵衣藻毒性效應的指標。根據(jù)不同重金屬脅迫下萊茵衣藻的光合參數(shù)Fv/Fm的EC50值，得到不同重金屬對萊茵衣藻的毒性強度排序為：Cr6+>Pb2+>Ni2+。Cr6+對萊茵衣藻的毒性效應最強，其原因可能是因為Cr6+具有強氧化性，可迅速對藻細胞的光合系統(tǒng)和DNA造成損傷[22]，并且萊茵衣藻的自身結(jié)構(gòu)可能對Cr6+的脅迫更加敏感。

4 結(jié)論與展望

以萊茵衣藻為受試生物，利用快速葉綠素熒光誘導動力學分析和毒理測試方法，開展3種典型重金屬(Cr6+、Pb2+和Ni2+)對萊茵衣藻的單一毒性效應試驗，分析不同種類和不同濃度重金屬對萊茵衣藻的光合性和抗氧化系統(tǒng)的影響，得到如下結(jié)論：

(1) 重金屬Cr6+、Pb2+和Ni2+對萊茵衣藻的單一脅迫作用均能對其生理過程產(chǎn)生一定的毒害影響：3種重金屬均可降低藻細胞的光合活性，增加膜脂質(zhì)過氧化程度，抑制抗氧化酶活性，進而破壞藻細胞的整體穩(wěn)態(tài)，影響其正常生長。

(2) 萊茵衣藻對不同種類和不同濃度的重金屬毒性效應響應程度不同，三種重金屬對萊茵衣藻的毒性效應大小排序為：Cr6+>Pb2+>Ni2+，即萊茵衣藻對Cr6+脅迫最敏感。另外，在3種重金屬對萊茵衣藻的單一毒性效應試驗中，毒性評價指標Fv/Fm對重金屬毒性效應的響應最為敏感，說明利用快速葉綠素熒光誘導動力學分析能夠快速、高效地檢測出不同重金屬對藻類毒性效應的強度。

本文研究結(jié)果表明，萊茵衣藻和快速葉綠素熒光誘導動力學分析在重金屬污染廢水監(jiān)測中有較大的應用價值。但在實際廢水環(huán)境中，重金屬通常以共存的形式出現(xiàn)，并且其相互作用會對生物體造成不同的未知生理效應。因此，下一步的研究工作還需考察廢水中共存重金屬對萊茵衣藻的脅迫作用，以使萊茵衣藻在重金屬廢水監(jiān)測中發(fā)揮更大的實際應用價值。